去除核酸中蛋白质的方法

核酸试剂操作方法核酸试剂是用于提取、纯化和测定核酸分子的化学试剂。

核酸试剂的操作方法可以大致分为以下几个步骤：样品处理、溶解、纯化、测定等。

下面我将详细介绍每个步骤的操作方法。

1. 样品处理：在进行核酸提取前，首先需要对样品进行处理。

根据实验的目的和样品的性质，可以选择不同的样品处理方法。

比较常见的样品处理方法包括：细胞裂解、血浆或血清的凝固、骨髓抽提等。

在样品处理过程中要注意采用无菌操作，避免污染。

2. 溶解：将处理后的样品或沉淀加入适当的溶解液中，使核酸完全溶解。

常用的核酸溶解液包括：TE缓冲液、含EDTA的去离子水等。

在样品溶解时，需轻轻摇晃或轻轻慢搅拌，避免生成气泡。

3. 核酸纯化：核酸溶解后，需要进行纯化以去除与核酸有关的杂质，如蛋白质、盐类和酶等。

常用的核酸纯化方法有酚-氯仿法、硅胶柱法、离心柱法等。

不同的纯化方法适用于不同的样品类型和实验需求。

在纯化过程中，需要根据试剂的使用说明进行操作，以保证纯化效果。

4. 核酸测定：核酸纯化后，可以通过一系列测定手段来确定核酸的浓度和纯度。

测定核酸浓度和纯度的方法有：比色法、荧光法、紫外吸收法等。

在进行核酸测定时，需要根据试剂的使用说明和仪器的操作步骤进行操作，确保结果的准确性。

除了上述操作步骤外，核酸试剂的操作还需要注意以下几点：1. 实验室条件：进行核酸实验需要在洁净、无菌的实验环境下进行，避免外源性DNA和RNA的污染。

2. 消毒处理：实验前需要将操作台面、试剂瓶盖、离心管等实验器材进行消毒处理，以避免细菌、病毒的污染。

3. 无菌操作：在进行核酸提取和纯化操作时，需采用无菌技术，包括用纯化的试剂和器皿、带手套、使用滤芯枪头等。

4. 试剂保存：核酸试剂的保存条件需根据试剂的要求进行，常见的存储条件包括-20保存、避光保存等。

5. 操作技巧：在进行核酸试剂操作时，需熟悉试剂的用途和使用方法，并掌握相关实验技巧，以保证试剂的有效使用。

总之，核酸试剂的操作方法涉及样品处理、溶解、纯化和测定等步骤。

核酸提取常见试剂的作⽤原理异硫氰酸胍强⽤⼒的蛋⽩质变性剂，能迅速溶解蛋⽩质，导致细胞结构破碎，核蛋⽩由于其⼆级结构的破坏消失⽽迅速与核酸分离。

胍盐是破坏蛋⽩质三维结构的离液剂，在通常使⽤的蛋⽩质变性剂中作⽤最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋⽩质转换成⼀随机的卷曲状态。

含有强⼒的阴离⼦和阳离⼦基团，它们可以形成较强的氢键。

在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，⽽去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏⽔作⽤。

盐酸胍、尿素盐酸胍是⼀个核酸酶的强抑制剂，它并不是⼀种⾜够强的变性剂，可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。

4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋⽩和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋⽩-变性剂复合物，当复合物被除去，从⽽引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋⽩不断转变为复合物，最终导致蛋⽩质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作⽤，能形成氢键，当浓度⾼时，能破坏⽔的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为⾮极性残基的较好溶剂，使蛋⽩质内部的疏⽔残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。

⾼浓度尿素使蛋⽩质变性并抑制Rnase活性⼗⼆烷基肌氨酸钠使蛋⽩质解体变性巯基试剂1防⽌蛋⽩质或酶等（如辅酶A）分⼦中SH基团氧化成⼆硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。

DTT，DDTE、巯基⼄醇应⽤最⼴，⾕胱⽢肽也常应⽤，由于他是⽣物体内的还原剂，同时氧化后能被⾕胱⽢肽还原酶原位释放。

DNA提取中，常使⽤巯基⼄醇，维持缓冲液的还原环境，防⽌多酚类氧化，由于具有⼀定的毒性，浓度不应⾼于2%。

巯基⼄醇β-巯基⼄醇的主要作⽤是破坏RNase蛋⽩质中的⼆硫键（肽和蛋⽩质分⼦中的半胱氨酸残基中的键）。

1 还原蛋⽩质⼆硫键，使Rna酶变性2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰⿊⾊，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸⼆酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋⽩质的巯基蛋⽩质提取中需要巯基⼄醇还原⼆硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏⽔键、盐键、氢键、范德华⼒使蛋⽩质变性但不影响肽键和⼆硫键，不能使蛋⽩质彻底变性加上还原剂巯基⼄醇或DTT，能还原⼆硫键，使RNA彻底变性DTT⼆硫苏糖醇刺激性⽓味要⼩很多，毒性也⽐巯基⼄醇低很多。

生化分离技术第三版课后答案第一单元简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。

答：常用的细胞破碎方法有：组织捣碎、珠磨法、高速匀浆法、挤压法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法、干燥法等。

1、组织捣碎，其原理是利用机械运动产生剪切力的作用破细胞，利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。

（10000～20000r/min）；适用范围：动植物组织。

2、珠磨法，工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；特点：一般可以达到较高的破碎率，但同时为控制温度，冷耗能耗较高，成本亦随之增加；适用范围：微生物（细菌）与植物细胞。

3、高速匀浆法，工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂；特点：破碎程度较高，而其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大；适用范围：较柔软、易分散的组织细胞。

4、挤压法，工作原理：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎；适用范围：细菌（革兰氏阴性菌）5、超声破碎法，工作原理：声频高于15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理不详，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，空化现象是在强声波作用下，气泡形成、胀大和破碎的现象；特点：多采用短时多次处理样品，且由于过程产热较多，常在冰浴中进行超声；处理少量样品，操作简便，液量损失少；适用范围：微生物细胞。

6、酶溶法，又分为外加酶和自溶两种，外加酶原理：用生物酶将细胞壁核细胞膜消化溶解；特点：具有选择性释放产物、核酸泄露少、细胞外形完整，但价格较高、通用性差。

自溶法。

原理：控制一定条件，诱发微生物细胞产生过剩的溶胞酶或激发溶胞酶活力，使细胞自溶；特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性。

DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。

也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。

对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。

溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。

简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。

2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。

SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。

质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

次氯酸钠去除核酸的原理一、前言核酸是构成生物体的基本遗传物质，其中包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

在某些情况下，需要从生物样品中提取纯净的核酸，以用于进一步的实验研究。

次氯酸钠是一种常用的去除核酸的试剂，本文将详细介绍次氯酸钠去除核酸的原理。

二、次氯酸钠的作用机制次氯酸钠（NaClO）是一种强氧化剂，在水溶液中具有强烈的杀菌和氧化能力。

它的作用机制主要包括以下几个方面：2.1 次氯酸离子的生成当次氯酸钠溶解在水中时，会产生次氯酸离子（OCl-）和氢氧根离子（OH-），其化学方程式为：2NaClO + 2H2O -> 2Na+ + 2OH- + Cl2 + O2次氯酸离子是次氯酸钠溶液中主要的活性物种之一，它对核酸具有强烈的氧化作用。

2.2 次氯酸离子的氧化作用次氯酸离子具有强氧化作用，它可以与核酸中的碱基、磷酸骨架和核苷酸之间的双键进行氧化反应。

2.2.1 对碱基的氧化作用碱基是核酸的组成部分之一，而次氯酸离子可以与碱基中的氨基（NH2）和氮（N）原子发生氧化反应。

例如，次氯酸离子可以氧化嘌呤中的氨基，使其转变为氧化氨基（NH）：OCl- + R-NH2 -> R-NH + Cl- + H2O这样，次氯酸离子可以破坏碱基的结构，导致核酸的降解。

2.2.2 对磷酸骨架的氧化作用次氯酸离子也可以氧化核酸中的磷酸骨架，破坏磷酸骨架的连接。

磷酸骨架是核酸的主要支架结构，次氯酸离子的氧化作用会导致磷酸骨架的断裂，从而分解核酸分子。

2.2.3 对核苷酸的氧化作用核苷酸是核酸的基本单元，次氯酸离子可以氧化核苷酸中的碱基和磷酸骨架，导致核苷酸的断裂和降解。

2.3 次氯酸离子的杀菌作用除了对核酸具有氧化作用外，次氯酸离子还可以杀灭生物样品中的微生物。

由于次氯酸离子具有较高的氧化还原电位，它能破坏微生物细胞膜和蛋白质，引起细胞的死亡。

三、次氯酸钠去除核酸的步骤次氯酸钠去除核酸的步骤如下：3.1 细胞裂解首先，需要对生物样品中的细胞进行裂解，使核酸暴露在溶液中。

动物组织中核酸的提取与鉴定一、原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。

二、试剂1.地衣酚（orcinol）试剂：称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。

2.二苯胺试剂：称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。

3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml；5. 95%乙醇（冷）；6. 氯仿；7. 异戊醇三、器材a)冷冻离心机（3000rpm）b)组织捣碎机或组织匀浆器c)不锈钢剪刀d)冰浴e)试管、试管夹f)量筒、吸管g)带塞比色管、带塞离心管h)玻棒、烧杯i)电炉等三、方法1. 制匀浆将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。

将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。

上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。

2. 核酸的抽提2.1RNA的提取0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。

用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。

低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。