法医学重点第一章绪论第一节概述1.法医病理学的研究对象是尸体2.（选择）法医病理学研究检验目的是: ①确定死亡原因(首要任务)②判断死亡方式③推断死亡时间④推断致伤物⑤个人识别⑥医疗事故鉴定⑦推断损伤时间⑧损伤和疾病关系3.法医物证学:其研究和检验对象是源于人体的生物性检材,主要是各种人体成分及其分泌物与排泄物,其中最常见的是血液(血痕),其次是精液(斑),阴道液(斑),唾液(斑),毛发,牙齿及骨骼等.第三节法医学的工作内容（选择）4.法医学的工作内容: ①现场勘验②活体检查③尸体剖验④物证检验⑤书证检验(一定要有公章)5.物证:是指对案件的真实情况有证明作用的物品和痕迹。
第五节法医学发展史及展望6.现存最早的系统古代法医学著作是《洗冤集录》,为中国古代伟大的法医学家宋慈所撰。
7.1598年,意大利巴勒莫大学教授Fortunato Fedele出版了《医师的报告》,这是欧洲第一部全面而系统的法医学著作。
第二章死亡与死后变化第一节死亡8.死亡方式:心脏性死亡,呼吸性死亡,脑死亡(原发性,继发性)9.死亡过程:濒死期,临床死亡期(全身各器官组织并未全部死亡,可进行器官移植),生物学死亡期(全身所有的组织细胞相继死亡) 10. ①非自然死亡(暴力性死亡) ②自然死亡(非暴力性:生理性死亡,病理性死亡)生理性死亡:也称衰老死,指由于机体的自然衰老,体内各组织器官的生理功能逐渐减退直至衰竭尤其是脑,心或肺的自然衰竭以致不能维持生命而导致死亡.病理性死亡:指由于各种疾病的发展,恶化而引起的个体死亡.11.（选择）死亡原因:是指直接或间接促进死亡的损伤或疾病.根本死因:引起死亡的初始原因(原发性自然疾病或暴力性损伤) 直接死因:感染,出血,栓塞,中毒,全身衰竭辅助死因:根本原因外的自然疾病或损伤诱因:精神因素联合死因:两种或两种以上12.（简答或填空）死亡方式:①自杀死:蓄意的自己对自己施加暴力手段终止自己的生命的死亡事件.②他杀死:用暴力手段剥夺他人生命的死亡事件a.非法他杀死:即故意杀人,是法医学实践中最常见的.b.合法他杀死:在法律允许范围内的他杀(死刑,正当防卫,合法堕胎,引产)c.过失伤害死:家庭纠纷,斗殴,虐待老人或儿童,监狱内对犯人的伤害.③意外死:灾害死,意外事件,自杀,自残致死第二节死后变化13.早期死后变化:指死后24h内尸体发生的变化14.早期死后变化包括:肌肉松弛,皮革样变,角膜混浊,尸冷,尸斑,尸僵,尸体痉挛,自溶和自家消化.15.尸斑:尸体血液因重力而坠积于低下部位未受压迫的皮肤血管内,并在该处皮肤呈现出有色斑痕(多为暗紫红色),称为尸斑.①形成机制:人死后血液循环停止,血液因重力作用顺着血管向尸体的低下部位的血管网内,并使之扩张,红细胞沉积于低下部位,透过皮肤呈现出紫红色或暗红色的尸斑.②尸斑的发展:沉降期尸斑,扩散期尸斑,浸润期尸斑.16.尸僵:人死后各肌群发生僵硬将关节固定而使尸体呈强直状态,称为尸僵.17.自溶:人死后组织,细胞受细胞自身固有的各种酶的作用而发生结构破坏,使组织软化甚至液化,称为自溶.18.晚期死后变化:24h以后发生的变化. ①尸体腐败②霉尸③白骨化19.保存型尸体变化: ①木乃伊②尸蜡③泥炭鞣尸④浸软20.根据温度推断死亡时间: ①直肠温度测量法(肛门) ②肝脏温度测量第三章机械性损伤第一节概述第二节机械性损伤的基本形态21．以组织器官形态结构改变为主的损伤包括：擦伤，挫伤，创，骨折，内脏破裂和肢体离断。
3019高级生物物证学
【原创版】
目录
一、生物物证学的概述
二、生物物证学的发展历程
三、生物物证学的应用领域
四、生物物证学的研究方法和技术
五、生物物证学的未来发展趋势
正文
生物物证学是一门应用生物学和法学的交叉学科，主要通过研究生物样本的形态、结构和遗传信息，为法律事务提供科学依据。
生物物证学在我国的发展已有 30 余年的历史，经历了从无到有、从弱到强的过程。
自 20 世纪 80 年代以来，随着我国改革开放和法制建设的推进，生物物证学应运而生，逐步发展壮大。
最初，生物物证学主要应用于法医病理学、法医临床学等领域，为司法鉴定提供科学依据。
随着科学技术的进步，特别是分子生物学技术的发展，生物物证学的应用范围逐渐扩大，涵盖了遗传学、生物信息学等多个领域。
生物物证学在许多领域都有广泛的应用，如在刑事案件中，通过 DNA 鉴定、指纹鉴定等手段，可以协助警方侦破案件；在民事纠纷中，生物物证学也可以为判断亲子关系、鉴定遗嘱真伪等提供重要依据。
此外，生物物证学还在生物多样性保护、野生动物资源调查等领域发挥着重要作用。
生物物证学的研究方法和技术不断创新，从最初的显微镜观察到现代分子生物学技术，如 PCR、基因测序等，这些技术进步极大地提高了生物物证学的鉴定准确性和效率。
在未来，随着人工智能、大数据等技术的发展，生物物证学将更加精确、高效地为社会提供服务。
总之，生物物证学是一门充满活力和前景的学科，它将生物学与法学有机结合，为人类社会提供了有力的科学支持。
《生物微量物证检验》拓展学习文献资料（按课程大纲章节）第一章绪论1.孙言文．生物物证技术[M]．北京：中国人民大学出版社，1995.2. 叶元熙．生物物证技术[M]．北京：法律出版社，2003.3. 裴黎．现代DNA分析技术理论与方法[M]．北京：中国人民公安大学出版社，2002.4. John M. Butler著，侯一平，刘雅诚译．法医DNA分型：STR遗传标记的生物学、方法学及遗传学[M]．北京：科学出版社，2007.5．秦慧贞，赵武生. 植物物证鉴定[M]．南京：东南大学出版社，2007.6./course/details?uuid=8a833996-18ac928d-0118-ac928e00-0060&courseID=C0600237. 吕德坚，陆惠玲．DNA亲权鉴定．广州：暨南大学出版社，2005.第二章生物物证检材的发现、提取、保存和送检1. 吴梅筠．法庭生物学．成都：四川大学出版社，2006.2. 侯一平．法医物证学．北京：人民卫生出版社，2004.3. 李生斌，李昌钰．法科学．北京：中国人民公安大学出版社，2000.4. 中华人民共和国公共安全行业标准（法医学物证检材的提取、保存与送检）：/moj/2008sfjd/2005-12/05/content_791683.htm第三章植物微量物证检验及其在法庭科学中的应用1．秦慧贞，赵武生. 植物物证鉴定[M]．南京：东南大学出版社，2007.2.孙言文．生物物证技术[M]．北京：中国人民大学出版社，1995.3. 叶元熙．生物物证技术[M]．北京：法律出版社，2003.4. John M. Butler著，侯一平，刘雅诚译．法医DNA分型：STR遗传标记的生物学、方法学及遗传学[M]．北京：科学出版社，2007.5．张幼芳. 植物物证检验及其在法庭科学中的应用[J].中国法医学杂志，2003，4.第四章动物微量物证的显微鉴定1．景松岩，张伟．毛皮学．哈尔滨：东北林业大学出版社，19932．费荣梅，景松岩．野生动物产品学．哈尔滨：东北林业大学出版社，20023. 孙言文．生物物证技术[M]．北京：中国人民大学出版社，1995.4. 叶元熙．生物物证技术[M]．北京：法律出版社，2003.5．东北林业大学《毛皮学》精品课程网站：/mpx/jxzy/mptpp/index.asp6．四川大学《法医物证学》精品课程网站：/course/details?uuid=8a833996-18ac928d-0118-ac928e00-0 060&courseID=C060023第五章生物微量物证的DNA检验1. 吕德坚，陆惠玲．DNA亲权鉴定．广州：暨南大学出版社，2005.2. 黄娅琳．12S rRNA和Cyt b基因序列测定在獐乳制品鉴定中的应用．四川动物，2008，27（6）：1111-1114.3. 黄娅琳．一种简便的DNA 提取方法在动物毛发检验中的应用．中国司法鉴定，2008（2）：25-27.4. 黄娅琳，林建新．利用STR位点进行牛亲子鉴定的研究．畜牧与饲料科学，2010，31（1）：120-121.5 张林，庞灏．法医物证学实验指导．北京：人民卫生出版社，2008.6. 吴梅筠．法庭生物学．成都：四川大学出版社，2006.7. 侯一平．法医物证学．北京：人民卫生出版社，2004.8. 郑秀芬．法医DNA分析．北京：中国人民公安大学出版社，2002.9. 邓亚军．DNA亲子鉴定实用指南．北京：群众出版社，2008.10. 孙言文．生物物证技术[M]．北京：中国人民大学出版社，1995.11. 叶元熙．生物物证技术[M]．北京：法律出版社，2003.12. 伍新尧，杨庆恩，刘超等[M]．法医物证学实验指导．北京：人民卫生出版社，2008.13. 裴黎．现代DNA分析技术理论与方法[M]．北京：中国人民公安大学出版社，2002.14. John M. Butler著，侯一平，刘雅诚译．法医DNA分型：STR遗传标记的生物学、方法学及遗传学[M]．北京：科学出版社，2007.15．四川大学《法医物证学》精品课程网站：/course/details?uuid=8a833996-18ac928d-0118-ac928e00-0 060&courseID=C060023第六章法庭科学DNA数据库1.John M. Butler著，侯一平，刘雅诚译．法医DNA分型：STR遗传标记的生物学、方法学及遗传学[M]．北京：科学出版社，2007.2.裴黎．现代DNA分析技术理论与方法[M]．北京：中国人民公安大学出版社，2002.3. 吴梅筠．法庭生物学．成都：四川大学出版社，2006.4. 侯一平．法医物证学．北京：人民卫生出版社，2004.5．DNA数据共享：精确打击刑事罪犯。
第一章绪论法医物证学：法医物证学是应用多种学科的理论知识和技术研究并解决涉及法律方面有关生物性检材的检验与鉴定的一门学科;应用的学科包括：医学、生物学、遗传学、免疫学、血型血清学、生物化学及分子生物学等;法医物证学：是以法医物证为研究对象,以提供科学证据为目的,研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科;法医物证学是法医学的分支学科,其研究内容属于法医学中的物证检验部分,是法医学研究的主要内容之一;法医物证是一门应用科学,研究的方法涉及多种学科包括：①化学,②物理学,③电子计算机,④形态学,⑤免疫血清学,⑥生物化学,⑦分子生物学,⑧遗传学等方法;法医物证的特点：①法医物证的稳定性受环境条件的影响；②法医物证属于“科学证据”;第二章法医物证分析的遗传学基础1、何谓遗传标记个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时,这种遗传性状就成为遗传标记GM;2、何谓基因、基因型和表型1)基因型：是指个体一个或多个基因座上等位基因的组合,是生物体可见性状的实际基因组成;2)表型：是指生物体某特定基因所表现的性状;表型由基因型决定;3、Hardy-Weinberg平衡定律的前提条件和意义1)前提条件：群体无限大、随机婚配、没有突变、没有大规模的迁移和没有选择因素的影响;2)结论：群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变;3)意义：4)反映基因频率和基因型频率的关系纯合子基因型频率=基因频率的平方,杂合子=该两基因频率乘积的二倍5)群体样本的检验4、非父排除概率P23PE是指孩子的非亲生父亲的男子,能够被某个遗传标记系统排除的概率;PE用于评估某一遗传标记系统在亲权鉴定案件中的实用价值;5、何谓个人识别概率P22个人识别概率DP是指在群体中随机抽取两个体,两者的遗传标记表型不相同的概率;DP是评价该遗产标记系统识别无关个体效能大小的指标,DP越高,效能越强; 第三章 DNA多态性的分子基础1、何谓DNA多态性P371)在基因组DNA中,由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性;2)按照DNA遗传标记的结构特征,DNA多态性可分为长度多态性和序列多态性;2、何谓VNTRP37小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR;3、何谓STR微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列,STR;第四章 DNA长度多态性1、RFLP2、Amp-FLR3、DNA指纹图谱的基本特征1)遗传方式：孟德尔规律、所有片段独立遗传2)个体的组织同一性：稳定一致3)群体遗传学特征：4)突变率：配子细胞形成时重排、重组与交换4、DNA纹印图谱的基本特征1)高多态性2)遗传规律：共显性3)个体组织同一性：一致4)群体遗传学特征：5)高突变率：配子细胞形成时重排、重组、交换5、何谓扩增片段长度多态性分析Amp-FLR：采用PCR技术扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法;6、RFLP与Amp-FLP技术有何异同P747、STR分型用于法医物证鉴定的主要优点1)高灵敏度：适用于微量降解检材2)高鉴别能力：节约检材、试剂和提高效率3)标准化分型：实现数字化结果,利于实验室间数据交换,建立数据库8、何谓miniSTRminiSTR分型有何法医学应用价值1)miniSTR：通过重新设计引物,使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列,从而降低扩增产物的大小,进一步提高灵敏度和分型成功率,这种技术称为短片段STR分型或miniSTR分型;2)miniSTR法医学应用价值：STR基因座的扩增片段较短,灵敏度更高,尤其适用于微量或降解生物检材的DNA分型；等位基因片段长度范围较窄,不易发生因小等位基因的优势扩增而造成的等位基因丢失现象；可对多个STR基因座进行复合扩增,从而节约检材、降低成本,提高单次检测的信息量9、何谓多基因座复合扩增1)在一个PCR体系中同时扩增多个靶基因座的方法叫做复合扩增;2)复合扩增可提高单次检测的信息量,提高个人识别率,也可降低成本和检材的消耗;10、Y-STR有何法医学应用特点1)Y染色体为男性特有2)Y-STR呈父系遗传特征3)单倍体遗传：在减数分裂过程中,Y-特异性区不发生重组,所有Y-STR基因座均呈连锁遗传,等位基因频率不能以相乘方法计算4)GD=PE5)结果不具有唯一性,不能认定11、Amelogenin基因名解牙釉基因AMG：位于X染色体Xp22,编码牙原基质牙釉质蛋白,故命名牙釉基因;在人Y染色体中心粒附近有一类牙釉基因AMGL,与牙釉基因的碱基序列有90%同源性;用一对特异性引物可同时扩增AMG和AMGL序列片段,X特异性片段长度为977bp,Y 为788bp;扩增后,男性可获得两条带,女性只观察到一条带;但是其扩增产物较长,不适合腐败血痕、过于陈旧血痕的性别鉴定;第五章 STR自动分型1、简述STR自动分型技术的主要步骤1)DNA自动化提取2)PCR多色荧光标记STR复合扩增3)PCR产物电泳前处理4)自动毛细管电泳结合激光诱导的荧光检测5)自动数据采集并分型2、何谓off-ladder1)在STR分型图谱中,常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数字命名,在分型图谱中被标识为off-ladder2)漂移作用和新等位基因都可标识为off-ladder3、何谓LCNLCN：基因组含量小于100pg的样本称为低拷贝DNAlow copy number;第六章 DNA序列多态性DNA多态性DNA polymorphisms：基因水平上的多样性来自基因的突变,当基因突变以等位基因形式在群体中得以保留,并能够从亲代遗传给子代,可形成个体间的遗传差异;不同个体间的遗传差异形式是不同的等位基因组成;等位基因之间也可以是因为碱基的插入或缺失引起的片都能构成具有个体特征的DNA遗传标记;DNA遗传标记可以出现在编码区,也可以存在于非编码区;在基因组DNA中,这种由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性;DNA长度多态性DNA length polymorphisms：是指同一基因座上各等位基因之间的DNA片段长度差异构成的多态性;DNA长度多态性靶序列主要是指可变数目串联重复序列VNTR,VNTR既存在于小卫星DNA中,也存在于微卫星DNA中;由于命名习惯和为了便于区分,通常小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR,而把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列STR;DNA序列多态性sequence polymorphisms：是指一个基因座上,因不同个体DNA序列有一个或多个碱基的差异而构成的多态性;可以理解为该基因座上所有等位基因DNA长度相同,但是它们之间的序列存在差异;在基因组DNA中,无论是编码区或者非编码区,单碱基替换是最基础的突变形式;在人类基因组范围内,如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基,其中最少的一种在群体中的频率不少于1%,就形成单核苷酸多态性single nucleotide polymorphisms,SNPs;限制性片段长度多态性restriction fragment length polymorphism,RFLP：RFLP分析是一种传统的分子生物学检测技术,广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各个方面;法医物证鉴定应用RFLP技术主要是对人类基因组中的VNTR基因座进行分型,其技术核心是DNA分子杂交,决定RFLP分析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特异性和探针的特异性;检测所用的探针多是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列,选择特异性不同的探针,在不同的杂交条件下,可以只检出单个VNTR基因座,也可同时检出多个VNTR基因座,前者称为后者检测所用的相应探针分别被称为单基因探针single-locus probe 和多基因探针multi-locus probe;Southern印迹杂交：是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法;一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量;其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程是高度特异的;由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性,综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱;Southern印迹杂交Southern blot是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值;Southern 印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交;凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着,附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置,从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小;琼脂糖凝胶电泳→硝酸纤维素膜吸印;限制性内切酶常见的有那些限制性内切酶restriction endonuclease：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶;Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解;合成引物的要点,PCR的反应组成：标准的PCR反应体系PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：①模板DNA,②寡核苷酸引物,③dNTP,④反应缓冲液,⑤TaqDNA聚合酶;PCR基本原理：PCR技术是模拟生物体内DNA的半保留复制,在体外合成DNA链的方法,在模板、DNA、引物、dNTP、Taq酶存在的条件下经过：“高温变性→低温退火→中温延伸”三步循环,获得大量扩增片段;合成引物的要点：引物合成是通过测定引物的OD值,溶解引物,最终合成引物的一个完善的过程;目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法;亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点;亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接;第一步,是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应;第三步,带帽capping反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应少于2%,用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉;第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯;经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上;再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去;常染色体STR与性染色体STR有什么不同常染色体STR：短串联重复序列STR是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列;它由2～6 个碱基对构成核心序列,呈串联重复排列,其长度多态性主要由核心序列拷贝数目的变化而产生;一般认为,人类基因组平均每6～10kb就有1个STR基因座,为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源;与限制性片段长度多态性产生的DNA 指纹相比,用聚合酶链反应技术PCR扩增STR 基因座产生的DNA纹印具有更高的灵敏度;STR扩增片段较短100～300bp,对于常见含部分降解 DNA的陈旧斑痕,PCR扩增STR比DNA指纹分析更容易成功;性染色体STR：人类Y染色体属于近端着丝粒染色体,由长臂Yq和微小的短臂Yp组成,DNA长度约60Mb;Y-DNA中大致有五类多态性遗传标记：卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA、插入或缺失及SNP;Y染色体STR基因座Y-STR是其中一种重要的遗传标记;与常染色体STR基因座相比,大多数Y-STR基因座具有复杂的串联重复结构：一个基因座内常含有两种以上不同的重复单位,恒定重复序列和可变重复序列同时存在;与常染色体STR基因座比较,Y-STR分型的法医学应用具有以下特点：①Y染色体为男性所特有,②Y-STR呈父系遗传特征,只能有父亲传递给儿子,③在减数分裂过程中,Y-特异性区不发生重组,④评估Y-STR鉴别能力的指标是遗传差异度,⑤和mtDNA一样,Y-STR分型结果不具有唯一性,其法医学应用价值在于排除,而不能认定;X-STR基因座具有伴性遗传的特征,X-STR的遗传特征既不同于常染色体,也不同于Y染色体,表现为性连锁特征;进行分型检测时,男性个体X-STR显现一条片段,女性杂合子则显示两条等位基因片段;低拷贝DNA low copy number,LCN：是指基因组含量小于100pg的样本;PCR循环测序的基本原理：PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA,应用PCR 技术测定DNA序列分为两个步骤：先利用PCR扩增靶序列片段,制备测序模板,然后再利用PCR直接测定序列;PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法,使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加,因此称为循环测序;每个测序循环包括：①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应;本次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物,在下一轮测序循环中,再次被变性,释放出模板链,作为又一轮引发反应的模板,同时积累下一轮循环产生的链终止产物;上述循环步骤重复20~40次,使链终止产物以线性方式获得扩增;DNA自动测序技术：DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物,于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术;4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物,即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色;这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开,相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像;阶梯中的每- DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示;荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内,不影响延伸反应,不影响标记后DNA片段的电泳性质;其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异,便于检测;荧光染料的掺入的方式有两种：一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5’端;4种荧光标记形成4种标记引物,测序反应分4个反应管进行,特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系,例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内,因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE;这种方式被称为Dye-Primers;另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上,4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接,反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止,并且标记有4种不同的荧光发色基团,A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光;这种方式被称为Dye-Terminators;两种方式各有特点,不过前者要求A,G,C,T分4个反应进行,而后者的4组反应可以在同一管中完成;上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系,这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础;自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳,都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统;当DNA片段电泳通过检测窗口时,在激光束的激发下,片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录,由计算机自动作数据处理,最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像;不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序如图所示：MVPminisatellite variant repeat序列：称为具有变异核心序列的小卫星DNA,是一类既有长度多态性又有序列差异的DNA重复序列;第七章线粒体DNA多态性1、人类核DNA与mtDNA的比较P1792、mtDNA的特点1)唯一的核外DNA来源2)拷贝数多和异质性当两种不同的mtDNA序列存在同一个细胞、组织或者个体时称之为异质性3)母系遗传4)抗外切酶的环状结构有助于分子稳定性,对高度降解检材奏效5)瓶颈效应和复制分离6)阈值效应3、mtDNA分型的优点1)高变区作为遗传标记用于法医鉴定,高变区又称D-环区2)当细胞核DNA量不足而无法进行分型时,线粒体DNA技术分析是唯一可以利用的技术3)生物检材中的毛发、骨干、牙齿和其他严重降解的检材也依赖线粒体ＤＮＡ分析4)简单易操作、检材灵敏度高5)所需模板DNA减少6)减少DNA二级结构干扰4、mtDNA分型的主要方法1)mtDNA提取抽提2)PCR3)纯化PCR产物4)循环测序反应原理ddNTP→core,only 1 primer5、mtDNA分型的特殊问题1)mtDNA属于母系遗传,凡属同一母系的后代,mtDNA序列都是相同的;序列一致只能说明不排除同一个体的可能；2)mtDNA能够提供的信息量有限单倍型→排除同一性真正价值3)mtDNA的异质性违背同一个体mtDNA序列必然是一致的前提条件,给个体识别鉴定增加了变数；如果多份检材异质性出现在同一位置的同一碱基贬义,反而对认定同一个体检材有利6、mtDNA分型的法医学应用局限性1)分型技术要求高,耗时耗力耗钱2)识别力相对较低：非个体唯一,共有单倍体母系遗传3)异质性4)数据库规模：易高估其识别能力5)无法进行混合斑的检测第八章红细胞血型1、何谓ABO血型的正反定型1)正定性试验：根据RBC与特异性抗体的反应来分型,即用抗A抗体判定A抗原,用抗B抗体判定B抗原;2)反定型试验：依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝集原反应的性质,即用标准的A型RBC判定抗A抗体,用标准的B型RBC判定抗B抗体,同时也应用抗H抗体判定H抗原;2、试述ABO血型的DNA分型方法1)PCR-SSP序列特异性引物PCR技术：特异性强、重复性好 2PCR-RFLP3、中和试验的基本原理1)不完全Ab2)遮断作用3)判断不完全Ab是否与Ag凝集4、Oh型血清学特点1)在RBC上及唾液中均无ABH抗原,即不被抗A、抗B及抗H所凝集2)血清中有抗A、抗B及抗H凝集素,可分别凝集A、B、O型RBC第九章白细胞血型1、HLA抗原的分布1)HLA-I类抗原：分布广发,几乎存在于所有的有核细胞表面,以淋巴细胞上的密度最高;2)成熟RBC上没有HLA-A、B、和DR抗原,幼稚RBC却有;3)HLA-II类抗原：密度最高者为DC、单核细胞,一些吞噬细胞亚群及B细胞；4)II类抗原作为一种分化抗原在不同细胞上表达,大多数骨髓分化细胞具有HLA-II类抗原;2、HLA命名原则1)以大写字母A、D、C....表示HLA遗传区域中的座位2)HLA抗原特异性用数字表示3)为防止与补体组分命名相混淆,HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名4)HLA基因命名一般以4位数字表示,其中前2位数字表示对应最相近的HLA抗原特异性,后2位数字则用于表示亚型的等位基因,如A01015)如果出现第五位数字,则代表“沉默取代”,即该基因虽发生了个别碱基的替换,但新密码子与原密码子属简并密码,不影响所编码的氨基酸序列6)第6、7位数字代表相应的启动子序列的多态性7)末尾加英文字母N表示无效基因或不表达基因8)在不能区分等位基因时,可允许最前面的2位或4位数字表示该HLA的特异性3、HLA遗传特征1)共显性遗传：每个HLA基因座表达一对抗原,人类HLA每个基因座上有众多等位基因;故如果血清学方法分型时,个体只检测出了一个抗原则有三种可能：该抗原的纯合子、HLA血清板不完全、存在一种至今尚未发现的抗原;2)单倍型遗传：单倍体是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基因遗传单位;3)连锁不平衡：HLA在实际群体调查发现,各基因座的基因并非完全随机组成单倍型,有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率,这种现象称为连锁不平衡;处于连锁部平衡状态说明HLA不同基因座的基因之间存在关联,具有一同遗传的趋向;4)HLA高多态性4、微量淋巴细胞毒性试验原理血清学分型1)微量淋巴细胞毒性试验或称补体依赖的细胞毒性试验,其分型原理为2)Ag-Ab-C：淋巴细胞膜上的HLA抗原与已知HLA血清中相应抗体结合后,形成抗原抗体复合物,再结合补体;3)C激活、破坏Lc：被激活的补体系统产生细胞毒性,攻击淋巴细胞,淋巴细胞膜破坏;4)死细胞着色：经过染色,染料进入破损细胞内着色,为阳性结果;5)计数：在倒置相差显微镜下观察,计数着色细胞所占细胞数目的百分比;5、HLA抗血清与交叉反应成功的关键是HLA抗血清的质量根据与抗原决定镞的反应,可把HLA抗体分为2组：1)抗体仅与一种HLA基因产物反应2)抗体能与不止一种HLA基因产物结合6、斑点杂交PCR-SSO分型方法将PCR扩增片段制成斑点,用等位基因特异性寡核苷酸探针ASO杂交,通过探针放射自显影结果进行HLA分型;反向斑点杂交RDB：把探针预先固定在膜上,标记PCR 引物;7、比较HLA血清学分型和DNA分型方法的可靠性HLA个体遗传差异的本质不是在于血清学方法所检测的抗原,而是在编码基因产物的DNA分子上;DNA分型优于血清学方法在于：1)试剂由化学合成,便于标准化和实验室间相互比较结果2)对检材要求不高血清学方法因需要活细胞而难以用于斑痕HLA分型3)血清学与DNA分型不完全相同的分型误差得以解决血清学方法发生的错误主要集中在：1)交叉反应抗原2)能否正确指定属于A9和A19的亚型,这些抗原多在交叉组内或是宽特异性抗原的裂解产物3)未能检出WHO命名的全部基因4)纯合子细胞中存在假阳性反应5)HLA-C大量“空白”基因,没有相应的抗血清检测它们的产物DNA分型技术促进和改善了对HLA多态性的分辨率8、HLA在法医学上的意义1)高度多态性2)出生时已完全发育,终身不变For 同一认定、个人识别第十章血清型1、等电聚焦技术for 亚型2、Hp分型原理、方法及法医学应用评价Hp：结合珠蛋白,血清中,能与Hb结合使Hb过氧化物酶样活性显着↑的糖蛋白分型：HP1-1、Hp2-1及Hp2-2遗传变异,Hp0无结合珠蛋白血症:→不能用于流产胚胎或＜4mon的新生儿的亲子鉴定;原因：1溶血性贫血,特发性贫血,白血病,尿毒症等,患者的血浆Hp含量明显下降； 2严重肝脏疾病如急性肝炎、肝硬化,Hp合成障碍；3胎儿及部分新生儿4个月后大部分能检出；4少数正常个体注意假阴性;分型原理：1)型别分离：PAG圆盘电泳：利用PAG的分子筛作用和电场作用,在柱状凝胶中分离不同型别的Hp蛋白;Hp-Hb,Hb过氧化物酶样活性使联苯胺→氧化为联苯胺蓝→显色；just for新鲜血清中Hp型别2)Hp亚型等电聚焦电泳分型3)DNA分型：利用基因特异性探针进行杂交分型、PCR扩增3、Gc分型原理、方法及法医学应用评价Gc：维生素D结合蛋白DPB,也成型特异性成分,电泳属a2球蛋白,主要生物学功能是结合和转运维生素D分型原理：1)免疫电泳2)PAG圆盘电泳3)等电聚焦技术4)DNA分型Gc法医学应用评价1)个人识别率为2)非父排除率为%3)室温保存4个月的血痕可检出Gc型。
