黄曲霉毒素检验方法

黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。

它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。

因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。

国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。

1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。

样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。

样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。

2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。

提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。

一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。

3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。

对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。

检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。

其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。

该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。

总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。

ELISA试验精密度评价
2.精密度评价的内容：批内、批间、日内、 日间和总不精密度（日内＋日间） 批内：在相同条件下对同一标本在尽可 能短的时间内进行多次重复测定 3.精密度评价实验 对稳定样品（低、中、高三个水平）重 复20次测定A，计算A的均值、s、S2和CV
ELISA试验临界值确定
1.临界值 实验结果处于（阴、阳性）分界点时的 样品中分析物浓度值 1.1当样品中分析物浓度处于临界值时，用 定性试验对样品进行多次重复检测，将产 生50%的阳性结果和50%的阴性结果
ELISA试验精密度评价
1.精密度
在相同条件下，对同一样品多次测量， 每次测量结果之间的接近程度 1.1不能用数字表示 1.2可数字表示的是其反义概念：不精密度 用标准差（s）或变异系数（CV）表示
ELISA试验精密度评价
1.精密度 1.3分析过程重复性的指标 1.4每个标本只做一次检验就发出结果 报告的重要误差（随机误差）来源 1.5临床上希望同一标本的多次检测结 果的精密度好，以减小随机误差
ELISA试验临界值确定
2.确立实验方法的临界值 2.1对已知浓度阳性样品进行系列稀释 2.2对各稀释度样品进行多次重复检测
2.3阴性和阳性结果各占50%的样品中 分析物浓度即为实验方法的临界值
实ห้องสมุดไป่ตู้设计的内容
1.实验原理 2.实验材料：仪器、试剂、耗材、标本等 3.实验方法：文条或表格（详细、具体） 4.实验结果判断 5.实验结果计算及统计学处理 6.室内质量控制 7.注意事项 8.影响因素

一、目的规范实验室检验方法。

二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。

（1）、将仪器后的电源开关打开。

（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。

（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。

一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。

（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。

否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。

（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。

一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。

（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。

（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。

（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。

（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。

（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。

荧光计每周需要标定一次。

如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。

Aug. 2019 China Food Safety ·27·理论研究THEORY 乳与乳制品中黄曲霉毒素检测方法和限量标准研究摘要：随着我国经济的发展与人们生活水平的提高，具有丰富营养价值的乳及乳制品逐渐成为人们日常生活的必需消费品。

与此同时，人们对乳及乳制品的期待不再局限于量的提高，而是对其质量和安全提出了更高的要求。

关键词：黄曲霉毒素M1；乳及乳制品；现状近年来，各种牛奶安全问题，尤其是黄曲霉毒素M1(aflatoxinM1，AFM1)污染问题的不断出现，给消费者健康带来危害。

AFM1主要存在于牛乳中，这主要是由于奶牛摄取了被黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)污染的饲料而产生的。

AFM1性质稳定，常见的3种牛奶加工方式——巴氏杀菌(L TL T，63℃保持30min)、高温快速巴氏杀菌(HTST，72℃保持15s)和超高温灭菌(UHT，135℃保持1～2s)均无法破坏其结构，因此控制饲料及原奶中AFB1的含量显得尤其重要。

黄曲霉毒素检测方法的研究进展液AFM1检测技术。

目前，对牛奶中AFM1的检测方法分为两大类，一类是以色谱技术为基础的物理化学分析方法，包括薄层层析色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法等;另一类是可快速检测的免疫化学方法，包括FL 法、ELISA 法、胶体金免疫层析(GICT)法。

酶联免疫吸附法。

酶联免疫吸附法（ELASA 法）是高样品量的筛查方法，目前黄曲霉毒素检测已经有成熟的商品化试剂盒。

主要原理是抗原、抗体反应与酶和底物反应进行显色，将显色的微孔板通过酶标仪进行定量分析。

ELASA 法主要有间接法、竞争法和生物酶标亲合素法。

目前竞争法是ELASA 常用的方法，原理是与黄曲霉毒素M1高亲和力的抗体预先包被于固定相的聚苯乙烯微孔中。

标准品和样品加入相应的微孔中，如果有黄曲霉毒素M1存在，会与包被的抗体结合。

取 8mL 丙酮与 92mL 三氯甲烷混合。 3.6 硅胶 G 薄层层析板 3.7 三氟乙酸 3.8 黄曲霉毒素标准溶液，10¦Ìg/mL
准确称取 1～1.2mg 黄曲霉毒素 B1 标准品，先加入 2mL 乙腈溶解，再用苯稀释定容至 100mL， 其浓度约为 10¦Ìg/mL，此标准溶液应通过紫外分光光度法测定其纯度，并以溶剂调整其浓度为 10¦Ìg/mL，避光，置于 4℃冰箱中保存。 3.9 黄曲霉毒素标准使用液，0.04¦Ìg/mL
3
将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 的基线上用微量注射器或血色素吸 管滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边缘和间距约为 1cm，点直径约为 3mm。在同一板上滴 加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：
第一点：10μL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液(0.04¦Ìg/mL).。 第二点：20μL 样液。 第三点：20μL 样液＋10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 第四点：20μL 样液＋10μL 0.2¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 6.2.2 展开与观察 在展开槽内加 10mL 无水乙醚，预展 12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加 10mL 丙酮－ 三氯甲烷混合液（8＋92），展开 10～12cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。 由于样液点上加滴黄曲霉毒素 B1 标准使用液，可使黄曲霉毒素 B1 标准点与样液中的黄曲霉 毒素 B1 荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的第三点中黄曲霉毒素 B1 为 0.0004¦Ìg，可用作检查 在样液内黄曲霉毒素 B1 最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四 点中黄曲霉毒素 B1 为 0.002¦Ìg，主要起定位作用。

中国果菜质量控制黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。

AFB1污染的物质包括食品中的花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等农产品及其加工产品；且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。

黄曲霉毒素无臭、无味、无色，在饲料中及其稳定，对家禽、家畜的健康威胁极大，作为饲料强制性卫生监控指标，目前有半定量薄层色谱法[1]、免疫亲和柱净化———高效液相色谱法[2]、免疫亲和荧光光度法[3]、酶联免疫吸附法[4]。

高效液相色谱法虽然灵敏度高，但是样品前处理繁琐，操作复杂；薄层色谱法虽然简便，但是灵敏度差，因此研究能够准确、快速检测饲料中AFB1的检测方法是十分必要且具有现实意义的。

1实验部分1.1材料与试剂甲酸，优级纯；乙腈，色谱纯；超纯水；饲料中黄曲霉毒素B1的检测刘超景赞（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000）摘要:采用高效液相色谱串联质谱法对饲料中黄曲霉毒素B1进行检测。

建立了以Inertsil ODS-3为液相色谱柱，以0.1%甲酸水、乙腈（0.1%甲酸）为流动相，质谱使用电喷雾离子源，正离子扫描，以313.0/285.0为定量离子对的LC-MS/MS 检测方法。

结果表明：该方法所测得的黄曲霉毒素B1在0~100.0ng/mL 内具有良好线性，检出限为2.8μg/kg ，加标回收率在93.3%~98.3%。

该方法适合饲料中黄曲霉毒素B1的分析检测。

与传统的薄层色谱、高效液相色谱法相比较，该方法具有分析速度快、操作方便、重现性好、灵敏度高等特点。

关键词:饲料；黄曲霉毒素B1；液质联用中图分类号:TS207文献标志码:A文章编号:1008-1038(2015)12-0025-03Detection of AFB1in FeedLIU ChaoJING Zan(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center,LeShan 614000,China)Abstract:We tested aflatoxin B1in feed with LC -MS/MS method.A method was developed with novel HPLC columnInertsil ODS -3,Mobile phase was 0.1%methanoic acid water,0.1%methanoic acid acetonitrile,combined with MS,which used positive ion scanning,and quantification ion pair was 313.0/285.0.A good linear in 0~100.0ng/mL.detection limit was 2.8μg/kg.Adding standard recovery was 93.3%~98.3%.This method has advantages of being fast,easy,reproducible and relatively sensitive compared with TLC and HPLC.Key words:Feed;AFB1;LC-MS/MS收稿日期:2015-06-26作者简介:刘超（1984—），男，助理工程师，研究方向为食品安全25. All Rights Reserved.中国果菜质量控制AFB1标准品（2μg/mL，农业部环境保护科研所）。

分析检测高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量韩 宇（四川省甘孜藏族自治州食品药品检验所，四川康定 626000）摘 要：目的：建立高效液相色谱法联合免疫磁固相萃取法测定农产品食品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）含量的分析方法。

方法：采用70%乙腈溶液提取花生、玉米、大豆、小麦、豌豆和绿豆样品中的AFB1，然后利用免疫磁珠净化、萃取和富集提取液中的AFB1，采用高效液相色谱法进行定量分析。

结果：方法的检出限为0.03～0.92 μg·kg-1，回收率为79.52%～97.53%。

利用该方法对市场上购买的20份花生、玉米、大豆、小麦、豌豆、绿豆样品中的AFB1进行检测，除了玉米和绿豆中未检测出AFB1外，其余实验样品中均检测出一定含量的AFB1。

结论：该方法简便、快速、准确，适用于复杂样品中黄曲霉毒素B1的测定。

关键词：高效液相色谱法；免疫磁固相萃取；黄曲霉毒素B1Determination of Aspergillus Flavus B1 in Agricultural Products by High-Performance Liquid ChromatographyHAN Yu(Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Food and Drug Control, Kangding 626000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Aflatoxin B1 (AFB1) in agricultural products by high performance liquid chromatography combined with immunomagnetic solid phase extraction. Method: AFB1 was extracted from samples of peanuts, corn, soybeans, wheat, peas, and mung beans using a 70% acetonitrile solution, and then AFB1 was purified, extracted and enriched by immunomagnetic beads, and quantitative analysis was performed by HPLC. Result: The limits of detection were 0.03～0.92 μg·kg-1, and the recoveries were 79.52%～97.53%. AFB1 in 20 samples of peanut, corn, soybean, wheat, pea and mung bean purchased from the market was detected by this method. AFB1 content was detected in all the other samples except corn and mung bean. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and suitable for the determination of aflatoxin B1 in complex samples.Keywords: high-performance liquid chromatography; immunomagnetic solid-phase extraction; aspergillus flavus B1黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有毒代谢产物，在自然界中分布广泛，在粮食和饲料等农产品中广泛存在。

2020版药典真菌毒素分析方法验证*方法依据：《中国药典》2020版 第四部 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则一 检测限、定量限信噪比法 1. 检测限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为3或略大于3，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以3得到的就是检测限，单位为μg/kg 。

2. 定量限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为10或略大于10，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以得到的就是定量限，单位为μg/kg 。

上述计算方法获得的数据须用含量相近的样品进行验证。

应附测试图谱，说明测试过程和结果。

二 准确度回收率验证： （以黄曲霉毒素为例）称取未检出黄曲霉毒素的样品6份，每份15g ，分别加入75μL 浓度为2.6ppm 的黄曲霉毒素混合标准品，按照2020版药典《通则2351 黄曲霉毒素测定法》进行操作。

回收率计算如下：1．黄曲霉毒素B 1、G 1回收率计算公式：%1005)(-)()(111111⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B2．黄曲霉毒素B 2、G 2回收率计算公式：%1005.1)(-)()(222222⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B表1 样品中待测定成分含量和回收率限度三 精密度1. 重复性在规定范围内，取同一浓度的供试品，用至少6份的测定结果进行评价。

或设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。

2. 中间精密度考查随机变动因素，如不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响，应进行中间精密度试验。

3. 重现性国家药品质量标准采用的分析方法，应进行重现性试验，如通过不同实验室协同检验获得重现性结果。

表2 样品中待测定成分的含量与精密度可接受范围关系。

流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。

另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。

此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。

若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。

所得溶液的浓度约为50g/L。

污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。

（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。

（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。

Science &Technology Vision 科技视界操作次序加入量孔号123456789150微升50微升A 00.10.250.512……DCCC C C CCC混匀23孔号234567891.890 1.548 1.2410.9190.6700.509 1.586 1.5400引言黄曲霉毒素B 1是一种高毒性、高致癌性的物质,除可引发肝癌外,也可引起其他部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿,是食品卫生部门常规的检测项目之一。

之前的方法都不能更好的检测出粮食作物、饲料和发酵食品中黄曲霉毒素的含量,今用酶联免疫吸附法能更灵敏准确的检出。

该法是把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种新型检测技术,其主要依据有三点:第一,抗原(抗体)能结合到固相载体的表面并仍保持其免疫活性;第二,抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性;第三,结合物与相应的抗原(抗体)反应后,结合的酶仍能催化底物生成有色物质,而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。

酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法:即间接法、抗体夹心法和竞争法。

前两种主要用于测定抗体和大分子抗原,适用于临床诊断上;而竞争法是测定小分子抗原的方法,因而尤其适用于食品卫生分析,该法主要有四步:1)将人工抗原吸附于固相载体,温育后清洗;2)加入含有抗原的待测液和抗体,温育后洗涤;3)加入酶标抗体,温育后清洗;4)加酶底物,温育后显色,并进行检测和结果判断。

图1黄曲霉毒素化学结构1实验部分1.1酶联免疫吸附法的原理利用固相酶联免疫吸附原理,将AFB 1特异性抗体包被与聚苯乙烯微量反应板的空穴中,再加入样品提取液(未加抗原)及酶标AFB 1抗原(已知抗原),使两者与抗体之间进行免疫竞争及应,然后加酶底物显色,颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB 1抗原结合的量,即样品中AFB 1多,则被抗体结合酶标AFB 1抗原少,颜色浅,反之则深。

样品处理：一、国标1.玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱【称取20g粉碎过筛试样（面粉或花生酱不需粉碎）置于250ml具塞锥形瓶中加30ml正已烷或石油醚和100mL50%甲醇水溶液(50ML甲醇+50mlddwater)在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。

振荡30min，静置片刻。

以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分漏斗中，待下层甲醇溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内】。

取20ml甲醇水溶液（相当于4g 试样）置于另一125mL分液漏斗中，加20ml三氯甲烷振摇2min。

静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。

放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中。

重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中。

最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。

将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2至3min后准确加入1ml苯-乙腈的混合液或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1ml苯-乙腈混合液。

用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解，混合，晶体即消失。

再用此滴管吸取上清液转移于2ml具塞试管中2.薄层板的活化新制薄层板100℃活化2h或制备好的薄层板105-110℃活化1h3.点样：在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。

一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约为3mm。

在同一块板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机的冷风边吹边加。

4.展开：展开槽（内长25cm、宽6cm、高4cm）在展开槽中加入展开剂静置平衡30min以上，然后在展开槽内加10ml无水乙醚，预展12cm。

取出挥干，再于另一展开槽内加10cm 丙酮-三氯甲烷（8:92）展开10-12cm取出。

值 ， 则 作 稀 释 定 量 检 测 ； 是 对 于 杂 质 多 的样 品 ， 否 但 须 采 取 横 板定 性 ； 同样 经 过点 板 、 开 、 展 观察 ， 荧 光 有 者 为 阳性 检 出 ， 一步 作 横 向确 证 ， 进 经再 次 检 测观 察
后 ，在 波 长 ３ ５纳米 紫 外 光 下 产生 蓝 紫 色 或 黄绿 色 ６
３ 酶 联 免 疫 吸 附 法 （ ＬＳ ） Ｅ ＩＡ
酶 联 免 疫 吸 附法 是 抗 原 （ 体 ） 附 剂 和 用 酶 抗 吸 标 记 的抗 体 （ 原 ） 标 本 中 的待 测 物 （ 原 和 抗 抗 与 抗 体 ） 特 异 的免 疫学 反 应 ， 测 定酶 活力 的方 法来 增 起 用 加 测 定 的 敏感 度 。大致 采 用 ２种 方式 检 测 黄 曲霉 毒 素， 即双抗 体 夹心 法与 竞争 法 。 有 实 验 采取 间接 Ｅ ＩＡ技术 ，检测 了抗 黄 曲霉 ＬＳ
液 ， 以 甲醇 （ １ 溶解 ， 再 １： ） 最后用专用黄 曲霉毒素 试剂盒测定。酶联免疫吸附法操作简便 ， 使用较为安 全 ， 由 于酶本 身 的不稳 定 性 ， 此 方法 检 验 黄 曲霉 但 用 毒 素 有 可 能带 来 假 阳 、 阴性 结 果 ， 而且 研 制 出 的黄 曲 霉 毒 索 快 速测 试 盒 多 以测 定最 具 毒 性 的 种 属 为 主 ， 食 品和饲料工业上利用其 界 定食 品或 饲 料 中黄 曲 霉 毒 素 的超 标 问题 。酶 联 疫 吸 附法 的检 测 精 度 还
供 了更广泛 的选择余地 ，适应 了不 同的检测 目的和 要求 ， 对几 种 常见 的方 法 介绍 如 下 ， 现 供参考 。
１薄层层析 法
薄 层 层 析 法 是 测 定 黄 曲霉 毒 素 的经 典 方 法 ， 原 理是 将 样 品经过 提 取 、 层 析 、 脱 、 缩 、 层 分离 柱 洗 浓 薄

人氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度 大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量 取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜 （0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子， 再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻 度，摇匀，即得。
《中国药典》2015年版柏子仁等14味易受黄曲霉毒素感 染药材及饮片增加了“黄曲霉毒素”检査项目和限度标准。
必备知识
高效液相色谱法检查黄曲霉毒素
本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中 的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲 霉毒素G2总量计），黄曲霉毒素
必备知识
注意事项 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器
（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿
冲洗干净。 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理 当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。
B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别1.0µg/ml、0.3µg/ml、 1.0/µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作 为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻 度，即得。
必备知识
高效液相色谱法检查黄曲霉毒素
供试品溶液的制备 取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加
中药制剂的杂质检查技术
—— 高效液相色谱法检查黄曲霉毒

黄曲霉毒素检测方法介绍黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。

黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus) 寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。

B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。

它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。

AFT目前已发现20余种。

AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。

其中以花生和玉米污染最严重。

家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。

主要的几种检验检疫方法:1,薄层层析法薄层层析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年,它被列为AOAC(Association of Official Agricultural Chemists)标准方法,该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.2,液相色谱法液相色谱(LiquidChromatography,LC)与薄层层析在许多方面具有相似性,二者互相补充.通常用TLC进行前期的条件设定,选择适宜的分离条件后,再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定.3,免疫化学分析方法利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),酶联免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫层析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定.(1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-HPLC法免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果,但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)含量,而且易出现假阳性结果,难以控制.免疫亲和柱法(包括荧光光度法和HPLC法)却能达到既定量准确又快速简便的要求.免疫亲和柱的使用可以避免传统TLC和HPLC的缺点,同时免疫亲和柱与TLC和HPLC法结合可以大大提高工作效率,提高灵敏度和准确度.黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段,用荧光计,紫外灯作为检测工具的快速分析方法.它克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒,异味的有机溶剂,毒害操作人员和污染环境的缺点.同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快,一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间;仪器设备轻便容易携带,自动化程度高,操作简单,直接读出测试结果,可以在小型实验或现场使用.可以进行黄曲霉毒素总量(B1B2G1G2)的测定,检测限可达到1ug/kg,达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg.黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全,可靠,灵敏度和准确度高.它采用单克隆抗体免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高.分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤,稀释后,用免疫亲和柱净化,以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度,然后用荧光分光光度计进行定量.也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中,对黄曲霉毒素B1,B2,G1,B2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg.(2) 酶联免疫吸附法:1996年,Nakane建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便,敏感,特异,可作为多种抗原或抗体的测定,20世纪70年代后期,该方法引入真菌毒素的检测中,下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素B1.原理:将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量.(3) 微柱筛选法可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的总量.原理:样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后,在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环,其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光,则样品为阴性(方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量.(4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选.一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选.检测方法分析薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法,由于其检测周期长,程序复杂,所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求.随着现代科学技术的不断发展,特别是免疫学,生物化学,分子生物学的不断发展,人们已创建了不少快速,简便,特异,敏感,低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法.而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用,引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急.免疫亲和柱法优点很多,但由于检测费用过高,而无法普及.而一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法似乎更适用于我国,值得推广.。

黄曲霉毒素方法标准嘿，咱今儿个就来唠唠黄曲霉毒素方法标准这档子事儿。

黄曲霉毒素啊，那可不是啥好惹的家伙！就像隐藏在我们生活里的小恶魔，稍不注意，它就可能蹦出来捣乱。

你想想，要是吃的东西里有了它，那对咱身体的伤害可不得了哇！那怎么才能把这个小恶魔给揪出来呢？这就得靠那些专门的方法标准啦！就好比我们去抓坏人，得有一套厉害的抓捕手段和规则，不然怎么能把坏人绳之以法呢？这些黄曲霉毒素方法标准呢，就像是一道道关卡，严格地检验着各种物品。

比如说食品吧，从原材料的挑选到加工制作，再到最后的成品，每一个环节都得按照标准来。

不然的话，那些黄曲霉毒素就可能偷偷混进去，到时候遭殃的不还是咱老百姓嘛！咱可以打个比方，标准就像是一个超级严格的老师，食品就是学生。

老师得时刻盯着学生，看看他们有没有犯错，有没有违反规定。

只有这样，才能保证学生们个个都优秀，都能让人放心。

再说说检测方法，那也是相当重要啊！这就好比医生看病，得有厉害的诊断手段才能准确知道病人得了啥病。

检测黄曲霉毒素的方法也得够精准、够灵敏，不能放过一丝一毫的蛛丝马迹。

不然，那些隐藏得很深的黄曲霉毒素不就逍遥法外了吗？而且啊，这些方法标准还得不断更新完善呢！为啥？因为黄曲霉毒素也会变着法儿地躲避检测呀！就跟那狡猾的狐狸似的。

所以我们的方法标准也得与时俱进，不断升级自己的“武器装备”，才能跟得上黄曲霉毒素的变化。

你说，要是没有这些严格的黄曲霉毒素方法标准，我们的生活得变成啥样？那还不得整天提心吊胆的，不知道吃进去的东西安不安全。

所以啊，咱可得重视这些方法标准。

政府部门得严格监管，企业得认真执行，咱老百姓也得有这个意识，多了解了解这些知识。

这样一来，我们才能把黄曲霉毒素这个小恶魔给彻底打败，让我们的生活更加健康、安全。

你想想，要是没有这些标准，那些不良商家不就可以随便乱来啦？那我们还能放心地吃东西吗？那肯定不行啊！所以说，黄曲霉毒素方法标准真的是太重要啦！它们就是我们健康的守护神，保护着我们不受黄曲霉毒素的侵害。

中药材中黄曲霉毒素检测方案黄曲霉毒素介绍黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。

其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。

当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。

当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

背景各级食品药品监管部门不断加大中药生产流通监管力度，努力保持中药质量总体稳定。

国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知(国食药监安[2012]187号中，要求加强对重金属及有害元素、农药残留、黄曲霉毒素等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。

《国家药品安全“十二五”规划》，规划中明确提出“开展药品快速检验技术研究，搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”、“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。

中药中黄曲霉毒素的检测方法2010版《药典》附录IX V 黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。

原理样品经甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，再经光化学衍生器柱后衍生，以提高检测准确性。

主要试剂及耗材气控操作架：含气泵黄曲霉毒素免疫亲和柱1ml或3ml光化学衍生器玻璃微纤维滤纸：直径11cm、孔径1.5µm玻璃试管：直径12mm，长75mm，无荧光特性注射器：10ml、20ml检测步骤样品粉碎——提取——洗脱液进样、亲和柱净化——化学衍生——检测数值气控操作架的使用说明：在样品粉碎后需要过亲和柱净化，也就是怎么方便亲和柱使用操作的问题，气控操作架能有效地提高这个环节的工作效率：1.连接组装好的气控操作架，将免疫亲和柱、注射器针筒与气控操作架连接;2.将处理后的溶液上样;3.调节空气泵旋钮以控制流速，使样液以1-2d/s的速度流出;4.待样液完全排干，用去离子水或蒸馏水以2-3d/s的流速洗涤两次，每次10ml;5.待液体完全排干，将样品瓶置于亲和柱下方，上样1ml甲醇以1d/s的速度流出至完全排干。

黄曲霉毒素的危害及检测方法研究进展赵晓野，王　儒，王　婷*，张　乐，林达峰（海南省食品药品检验所海口分所，海南海口 570311）摘　要：黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）主要是由真菌寄生曲霉和黄曲霉产生的次生代谢产物，在自然界中普遍存在，尤其在湿热的环境中极易产生，由于其具有极强的致癌性，研究其检测方法极其重要。

本文主要介绍黄曲霉毒素的危害、检测技术及黄曲霉的残留限量标准，并对应用较广的高效液相色谱-质谱联用法、液相色谱法、薄层色谱和酶联免疫吸附等测定黄曲霉毒素的方法、原理及应用进行了综述，以期为黄曲霉毒素检测技术的研究提供一定的参考。

关键词：黄曲霉毒素；危害；限量标准；检测技术Research Progress on the Harm and Detection Methods ofAflatoxinsZHAO Xiaoye, WANG Ru, WANG Ting*, ZHANG Le, LIN Dafeng(Hainan Provincial Institute for Food and Drug Control Haikou Branch, Haikou 570311, China)Abstract: Aflatoxins (AFT) are mainly secondary metabolites mainly produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. They are widely distributed in nature, especially in humid and hot environment. Because of their strong carcinogenicity, it is very important to study their detection methods. This paper mainly introduces the harm and detection technology of aflatoxins and the residue limit standard of aflatoxins; and summarizes widely used methods, principles and applications of high performance liquid chromatography-mass spectrometry, liquid chromatography, thin layer chromatography and enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of aflatoxins, in order to provide some reference for the research of aflatoxins detection technology.Keywords: aflatoxins; hazard; limit standard; detection technology黄曲霉是一种广泛分布的环境习居菌，经常在种植、贮藏、加工和运输过程污染玉米、花生等富含脂肪酸的粮食及相关食品和饲料，并会产生多种有毒次生代谢产物，统称为黄曲霉毒素。