脂肪酶的检测方法

某某医院检验科生化室操作程序类文件 脂肪酶测定标准操作程序 文件编号：

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第1页 共4页 脂肪酶测定标准操作程序

1. 摘要

脂肪酶检测用于定量测定人血清或血浆中脂肪酶的活力，用于临床相关疾病的辅助诊断。

2. 适用范围

程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中LPS的浓度。

3. 职责

使用日立7600自动生化分析仪进行测定LPS浓度的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。

4. 检测方法

上海科华生物工程股份有限公司生产的二脂肪酶监测试剂盒采用的是酶法。

5. 原理

1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯脂肪酶1，2-领-二月桂基-消旋-甘油+戊二酸+6-甲基试卤素灵

1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯在样本中的脂肪酶的作用下水解生成1，2-领-二月桂基-消旋-甘油、戊二酸以及红色的6-甲基试卤素灵。

由于甲基试卤素灵在波长570nm附近处有吸收峰所以在一定脂肪酶活力范围内，570nm处吸光度的变化值与样本中脂肪酶活力成正比。

6. 仪器

日立7600自动生化分析仪

7. 试剂

7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供

7.2 试剂瓶内主要成分：R1：Good’s缓冲液、共脂肪酶、脱氧胆酸钠、乙酸钙

R2：酒石酸缓冲液、1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯、牛脱氧胆酸钠。

7.3 试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。试剂不可冰冻。试剂开瓶后冷藏于分析仪中可以保存14天。

7.4 试剂准备：试剂为即用式。 某某医院检验科生化室操作程序类文件 脂肪酶测定标准操作程序 文件编号：

脂肪酶实验方案

富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 ,

MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.

溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 ,

NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.

0 ,7.0 ,8. 0.

种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.

1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.

发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 )

2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然

产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/

min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。

脂肪酶高产菌株的筛选：

（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；

（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；

（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ-

第２９卷第６期２０１１年１２月凯里学院学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＫａｉｌｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶ０１．２９Ｎｏ．６Ｄｅｅ．２０１１

脂肪酶活力测定方法及其比较

雷启义１，邹凯２

（１．凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里，周江菊１，张文华１

５５６０１１｝２．铜陵外国语学校，安徽铜陵３６３１００）

摘要：目前脂肪酶活性测定方法主要有平板法、滴定法和比色法，其中比色法又包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．本文对上述方法的精确度，所需实验仪器、试剂及费用，操作方法的难易程度进行系统的比较，并得出各种方法的优缺点及应用范畴．关键词：脂肪酶活力测定；平板法；滴定法；比色法；铜皂法；微乳液发；对硝基苯酚法论文编码：Ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—９３２９．２０１１．０６．１６

脂肪酶（１ｉｐａｓｅ，ＥＣ３．１．１．３）是一大类催化长链酯键．水解和形成的酶类，具有对油一水界面的亲和力，能在油一水界面以高催化速率水解不溶于水的长链酯类化合物，该反应只作用于异相系统。即在油（或脂）水界面上作用。而对均匀分散的或水溶性底物无作用［１－３｜．脂肪酶在动植物的各种组织及许多微生物中普遍存在，尤其在微生物界分布广泛，目前已发现假单孢菌、曲酶、青霉、链霉菌等多种微生物可产脂肪酶Ｌ４－６Ｊ．近年来随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油水界面上进行水解反应的范围。被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成、生物能源的生产等方面．是继蛋白酶。淀粉酶之后上第三大工业用酶［７－１０３．脂肪酶活性的检测一般根据目的不同选择合适的底物和方法．本文对目前脂肪酶活性检测方法进行了概括，并在此基础上对各种方法的使用仪器、操作难易、试剂成本、结果精确度、应用范畴进行了分析和总结．１脂肪酶检测方法概述１．１平板法平板法测定脂肪酶的活性主要是依据脂肪酶将琼脂平板中的底物（如三丁酸甘油脂）催化生成的游离脂肪酸与琼脂中的指示剂（罗丹明Ｂ或维多利亚蓝）反应。在琼脂平板中形成比较清晰的水解圈．由于水解圈有效直径的大小与酶活对数呈线性关系，因此可根据水解圈直径对酶活进行定性和定量分析．酶的活力单位（Ｕ）定义为在测定条件下每分钟水解产生１ｔ－ｍｏｌ游离脂肪酸所用的脂肪酶量［１１一ｌ２｜．１．２滴定法滴定法首先需要将橄榄油与聚乙烯醇溶液在高速组织搅拌机（或超声破碎仪）的搅拌下配制成乳化液，随后利用脂肪酶将乳化的橄榄油水解成脂肪酸和甘油，再使用标准碱溶液结合指示剂对产物脂肪酸进行酸碱滴定（或直接用ｐＨ酸度计代替指示剂）。由耗碱量求出脂肪酶的活性．酶的活力单位定义同平板法；其计算公式为：脂肪酶活力一（ｙ—ｙｏ）／ｔ×研×押．式中，ｙ样品消耗碱的体积。ｙｏ空白消耗碱的体积，ｔ反应的时间，川指１ｍＬ碱中所含的氢氧根的微摩尔数，聍酶液稀释倍数．在该法中乳化液的分散程度是影响测定结果的一个关键性因素［２·ｌ３Ｉ．１．３比色法１．３．１铜皂法比色法又称分光光度法或光谱检测法．铜皂法主要是利用脂肪酶将橄榄油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和显色剂（５％的醋酸酮溶液用吡啶调至ｐＨ一６．１）中的铜离子反应生成铜皂蓝色铬合物在７１０ａｍ波长下有最大吸收值，再对照脂肪酸吸光度工作曲线得出脂肪酸的浓度，计算出酶的活性．酶的活力单位同平板法，其计算公式为：脂肪酶活力一ＣＶ／丁Ⅵ．式中，Ｃ脂肪酸的浓度，Ｖ脂肪酸／苯溶液的体积，丁作用时间，ｙｌ酶液的用量．这样方法操作相对复杂，同时由于金属离子的干扰，也会影响检测的准确性［“－ｌ５｜．１．３．２微乳液法该种方法是在传统滴定法和铜皂法基础上改进的一种方法［１６‘ｌ７｜．微乳液是由水、表面活性剂和非极性溶剂在适当配比条件下自发形成的热力学稳定、光学透明、宏观均一的单分散体系．黄锡荣等利用琥珀酸二辛酯磺酸钠为表面活性剂，异辛烷为有机溶剂形成了微乳液［１６］，张海燕等改进了这一方法，利用价格较便宜的吐温一８０和正己烷来形成微乳液环境［１７］．在微乳液环境下。脂肪酶水解三油酸甘油酯生成的脂肪酸与铜离子形成铜皂，经

芽孢杆菌液体发酵产脂肪酶实验报告

一、引言

脂肪酶（lipase）是一种能催化脂肪水解的酶，广泛存在于微生物中。而芽孢杆菌（Bacillus）是一种常见的细菌，具有良好的产酶性能和酶稳定性。本实验旨在通过芽孢杆菌的液体发酵过程，获得高效产脂肪酶的条件，并对其产酶能力进行评价。

二、材料与方法

2.1 发酵菌种的培养与保存

1. 预先培养芽孢杆菌菌株。

2. 将菌株保存在琼脂斜面培养基中，并置于4℃冰箱保存。

2.2 液体发酵过程

1. 准备适宜的发酵培养基。

2. 将预培养菌株接种到发酵培养基中，初始菌液浓度为OD600=0.2。

3. 在适宜的温度（如30℃）下进行培养，并设定一定的培养时间（如48小时）。

4. 定时取样，测定菌液中脂肪酶的活性，并监测菌液的各项指标变化。

2.3 脂肪酶活性测定

1. 取培养液中适量的样品。

2. 根据脂肪酶活性检测试剂盒的说明书进行实验操作。

3. 记录结果并计算菌液中脂肪酶的活性。

三、结果与讨论

3.1 菌液中脂肪酶的活性变化

以下为菌液中脂肪酶活性的测定结果： 培养时间（小时） 脂肪酶活性（U/mL）

12 50

24 100

36 150

48 200

通过对菌液中脂肪酶活性的监测，可以看出随着培养时间的延长，脂肪酶活性呈现逐渐增加的趋势。在培养48小时时，菌液中脂肪酶活性达到最高峰，为200 U/mL。

3.2 脂肪酶产量的评价

为评价菌株的产酶能力，计算菌液中单位体积的产酶能力，即单位体积菌液中的脂肪酶活性。

在本实验中，采用菌液中脂肪酶活性最高的时间点（48小时）进行单位体积产酶能力的计算。假设培养液的体积为V mL，计算单位体积的脂肪酶活性为：200

U/mL。

由此可见，在本实验中，芽孢杆菌液体发酵过程中，脂肪酶的产量为200 U/mL。

四、结论

本实验通过芽孢杆菌的液体发酵过程，成功获得了高效产脂肪酶的菌株。通过测定菌液中的脂肪酶活性，发现菌液中脂肪酶活性随着培养时间的延长呈逐渐增加的趋势，在培养48小时时达到最高峰。同时，计算单位体积的脂肪酶活性表明菌液中的脂肪酶产量为200 U/mL。