农药学实验原理与方法

1 DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA

METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）

实验操作原理及方法

一、实验目的：

通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。

二、实验原理：

DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA

methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。

DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。

重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。

BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

Northern Blot原理及实验方法

发布日期：[2012-9-6] 共阅[41388]次

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

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实验方法：

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

（二）材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

（三）试剂

NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：

1． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

2． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

实验方法和原理： （一）方法 土壤污染监测的常用方法有：

重量法——适用于测定土壤水分； 容量法——适用于浸出物中含量较高的成分如Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-等测定；

气相色谱法——适用于有机氯、有机磷及有机汞等农药的测定； 分光光度法（AAS、AES、AFS）——适用于重金属如Cu、Cd、Cr、Pb、Hg、Zn等组分的测定。 （二）原理 土壤样品用HNO3—HF—HClO4混酸体系消化后，将消化液直接喷入空气—乙炔火焰。在火焰中形成的铜的基态原子蒸汽对光源发射的特征电磁辐射产生吸收。测得试液吸光度扣除全程序空白吸光度，从标准曲线查得铜的含量。计算土壤中铜的含量。

注：该方法的检出限为1mg/kg。 四、实验仪器和试剂： （一）仪器

原子吸收分光光度计，空气—乙炔火焰原子化器，铜空心阴极灯。 1.工作条件 测定波长：324.8nm；

通带宽度：1.3nm； 灯电流：7.5mA； 火焰类型：空气-乙炔，氧化型，蓝色火焰。 2.主要性能参数 灵敏度：0.1mg/L； 检出限：0.01mg/L；

适测浓度范围：0.2—10mg/L。 注：不同仪器其灵敏度和检出限有差异。 （二）试剂

1.硝酸：优级纯； 2.氢氟酸：优级纯； 3.高氯酸：优级纯； 4.铜标准溶液：市售标准液。一周前仪器分析实验课上配好的浓度分别为1mg/L、3mg/L、5mg/L的标准溶液及空白样。注：具体配制方法见上次的实验报告。 五、

实验步骤和注意事项： （一）土壤样品的预处理 1.把课前采集的土样均匀地摊开在一张比较厚的牛皮纸上； 2.挑出其中的动植物残渣及难以研磨碎的石块； 3.用四分法弃取土壤（留下四分之一）； 4.用筛子（尼龙筛网为100目）和研钵（白陶瓷制）对留下的土样进行反复的过筛—研磨，直至几乎全部过筛。

（二）土壤试液的制备 1.称取约0.5g土样于25mL聚四氟乙烯坩埚（高温消化罐）中，用少许水润湿； 2.加入15mLHNO3，在电热板上加热消化至溶解物剩余约5mL； 3.再加入5mLHF，加热分解SiO2及胶态硅酸盐； 4.最后加入5mLHClO4，加热至消解物呈淡黄色； 5.打开盖，先蒸至近干，然后取下冷却； 6.加入（1：5）HNO31mL微热溶解残渣，移入10mL容量瓶中定容。

1 临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术

中国中医研究院广安门医院临床检测中心

生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。

一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。

一、 实验反应原理及分析方法（理论依据）

二、 实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。

三、 质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。

四、 临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。

实验反应原理及分析方法(理论依据)

一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。

临床化学方法的分类

特别是自动生化仪方法的特点

以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。

在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。