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解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺摘要：本文通过试验探究的方式，以玉米清液为原料，以黑曲霉作为发酵菌株。
通过单因素筛选的方式优化清液培养基，并根据产酸量、菌丝球形态等，对各项指标进行明确，实现柠檬酸产量最大化目标。
根据试验结果可知，将初糖浓度设定为18%、采用分段通风转速控制方式，在发酵超过48h后可使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。
与传统带渣发酵相比，产酸量与转化率得到显著提升。
关键词：玉米清液；柠檬酸；发酵生产引言：粗玉米中蕴含着丰富的蛋白质，直接用其生产柠檬酸会使菌体飞速生长，对产酸造成严重阻碍。
为避免这一情况，可将玉米粉液化后清楚残渣，液内蛋白质含量较低，利用清液发酵柠檬酸，不但可缩短发酵周期，还可提高转化率。
当前，国内许多工厂已经陆续普及此种工艺，为提高玉米资源利用率，应对发酵生产工艺进行细致分析。
1试验材料与方法1.1材料与仪器本试验的菌株为黑曲霉；主要试剂为酵母粉、无水葡萄糖、FeSO4、玉米浆、a-淀粉酶，剂量为40000U/mL，肌醇；培养基为马铃薯葡萄糖琼脂、种子基础与发酵基础培养基；主要仪器设备为光学显微镜，型号为OLYMPU719068；电子天平，型号为FA2004N；总糖计，型号为WYT-J；恒温振荡器，型号为HZQ-QX；发酵罐，剂量为30L。
1.2试验方法1.2.1初糖含量与柠檬酸产量关系将清液中初糖浓度分别设定为16%、18%和20%，按10%接种量，在36.5℃、转速为400r/min、罐压为0.1MPa、通风为400L/h环境下发酵。
在初始发酵时，每间隔8h分别从不同浓度罐体内取样，对液体PH值与柠檬酸产量进行测定，在放罐完毕后称取菌丝体净重，检测净重变化情况，并检测残还原糖值[1]。
1.2.2还原糖测定通过费林试剂热滴定方式，以亚甲基蓝作为指示剂进行测定。
在空白滴定方面，分别吸取甲乙液体各5ml，放入250ml的锥形瓶内，滴入19ml左右的葡萄糖标准液，加热至沸腾，沸腾时间为30s，每2s滴入1滴，直至溶液蓝色消失，测定葡萄糖溶液的总体积，反复操作3次，记录平均值。
实验二柠檬酸发酵【课前预习】复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物分离工程所学到的微生物培养及生物物质分离的分离方法，了解影响微生物生长及生物物质提取过程中的各种影响因素。
【实验目的】1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；3. 通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
【实验要求】1. 10-15 人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
2. 总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O【实验用品】1. 实验主要仪器设备摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；析天平；蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
柠檬酸发酵PH值控制柠檬酸深层发酵过程中ph 值高低直接影响着生产菌（黑曲霉）的代谢活动以及柠檬酸的合成，同时在发酵过程中各种酶促反应也需要在适宜的ph 值下进行，因此发酵液的ph 值变化是发酵过程中一个重要的控制指标。
探讨ph值对微生物生长和代谢的影响以及引起发酵过程ph 值变化的原因，并采取相应的控制措施，对提高柠檬酸深层发酵产酸率具有重要的指导意义。
1 结果与讨论1、ph值对菌体生长和代谢产物合成的影响微生物生长的ph 值范围很广，大多数ph 值在5～9 之间，其活动的ph 值范围也存在最高、最适、最低三基点。
ph值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：一是影响酶的活性，当ph 值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；三是影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；四是ph值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
另外，ph值还会影响某些霉菌的形态。
根据不同微生物生长的最适ph值不同，可将微生物分为嗜酸性、嗜碱性、嗜中性微生物；同种微生物的生长最适ph值和产物积累ph值往往不一致，即使在产物积累阶段，由于ph值不同，也可能会得到不同的发酵产物。
2、发酵过程中ph值的检测发酵过程中ph值的检测十分重要，只有通过检测ph值才能及时发现发酵ph值的变化规律，判断发酵是否处在相应的最适宜ph 值范围之内，并及时做出相应的调节和控制。
实际生产中，通常采用ph试纸和ph电极对ph值进行测量。
采用取样测量发酵ph值，正常发酵每班间断取1～2 次，由于间断取样不能及时反映发酵过程的ph值，不利于发酵控制，而且多次取样会造成发酵液的浪费和环境的污染。
目前已试制成功适合于发酵过程适时监测ph值的电极，能连续测定并记录ph值的变化，将信号放大输出并显示或者记录下来，实现在线检测。
黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控
摘要:柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸,用途极为广泛。
我们厂柠檬酸发酵采用的是黑曲霉深层发酵技术，所以对黑曲霉发酵的过程的了解和分析有利于我们实现对发酵的控制和对发酵现在出现的问题从根本上找到解决的途径。
关键词:柠檬酸;黑曲霉合成途径; 黑曲霉代谢调控
发酵有机酸以柠檬酸为主,它占酸味剂市场的70 %左右。
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。
化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。
无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
一、柠檬酸发酵菌黑曲霉积累柠檬酸的机理
1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
上面的生物反应可以通过化学方程式来表示：
（1）C6H12O6→2CH3COCOOH+2ATP+2NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）葡萄糖通过酵解生成分子的丙酮酸
（2）CH3COCOOH+CO2+ATP→C4H4O5+ADP+Pi
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下氧化脱掉一个COOH（羧基）生成草酰乙酸（3）CH3COCOOH＋CoA＋NAD＋→CH3C0-CoA＋NADH＋＋CO2
丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱氢生成乙酰coa（即活化的乙酸：CH3COOH）（4）C4H4O5+ CH3COOH→C6H8O7
草酰乙酸和乙酰coa缩合成为柠檬酸
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸,其生物合成途径现普遍认为是:葡萄糖经
EMP、HMP 途径降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA ,另一方面经CO2 固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与CoA 缩合生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1
(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。
即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮
生成草酰乙酸为主。
酸羧化酶作用下固定化CO
2
二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控
柠檬酸是TCA 中一员,是许多组织和微生物中广泛存在的一种重要有机酸,它不仅为许多微生物利用同化,而且是一种重要的代谢调节因子。
通常微生物细胞中合成的柠檬酸进一步经TCA 循环,生物合成其他有机酸,提供合成细胞物质的中间体或彻底氧化产生能量,为细胞活动和耗能合成代谢提供能量。
因此正常生长的细胞中柠檬酸是不会过量积累的。
而黑曲霉积累柠檬酸受到四个方面的调节:糖酵解及丙酮酸代谢的调节和Mn2 + 调节;三羧酸循环的调节;O2 的调节。
（1）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响.
当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin 等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA。
（2）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。
但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。
2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：
顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。
顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。
因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。
α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰
乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。
②α-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
(3)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。
它对柠檬酸发酵的作用为：
(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。
(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
三、黑曲霉积累柠檬酸的机理
(1) 由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离子、锌离子、铁离于等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力,使细胞中形成高水平的铵离子,从而解除柠檬酸和ATP 对PFK酶的反馈抑制,使EMP 的代谢流增大。
(2) 黑曲霉中存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生ATP ,这样使细胞内的ATP 浓度下降。
因而减轻了ATP 对PFK、CS 的反馈抑制,促进了EMP 的畅通,增加柠檬酸的生物合成。
(3) 丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA 和CO2固定反应取得平衡,保证前体物乙酰CoA 和草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能力。
(4)α- 酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏,使黑曲霉中的TCA 变成“马蹄形”的代谢方式,减弱TCA ,降低细胞内ATP 浓度,另外使α- 酮戊二酸浓度升高。
反过来,又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶,降低柠檬酸的自身分解。
(5) 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸= 90∶3∶7 的平衡,顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸,即柠檬酸分解活力低。
一旦柠檬酸浓度升高到某一水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进柠
檬酸自身积累,使pH 降至2. 0 以下。
此时,顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸积累并排出体外。
