蛋白修饰分析流程

蛋白修饰研究策略分析（四）丨蛋白修饰相关的蛋白功能分析我们除了要对蛋白修饰进行检测，还要把蛋白修饰与蛋白功能结合起来进行分析才能真正阐明蛋白修饰对蛋白功能的影响。

下面我们介绍一下与蛋白修饰分析有关的常见策略和方法。

1.对蛋白修饰位点的氨基酸进行点突变磷酸化修饰常常发生的氨基酸残基包括丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）。

对于氨基酸位点的突变，以氨基酸的结构、空间位阻和电荷的相似性或差异性为基础，一般遵从下列规律：制备功能失活型突变体，常常会把原来的氨基酸残基替换为结构差异比较大的氨基酸残基。

例如，会把丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A），而把酪氨酸（Tyr，Y）突变为苯丙氨酸（Phe，F）。

在命名和标记上会用原来的氨基酸名称+氨基酸位点数字+突变后的氨基酸名称来表示，如S312A，代表把某一个蛋白的第312位Ser突变为Ala。

而制备功能组成型激活突变体，会把Ser、Thr或Tyr突变为一些酸性氨基酸，如谷氨酸（Glu，E）或天冬氨酸（Asp，D）。

在研究泛素化修饰的时候，大多数都要制备功能失活型突变体，而泛素常常偶联的氨基酸残基是赖氨酸（Lysine，K），按照氨基酸突变的规律，常常会把可能被泛素化的潜在目的蛋白的赖氨酸（Lysine，K）位点突变为精氨酸（Arginine，R）。

而在进行多泛素偶联的研究时，会利用泛素表达载体、泛素连接酶表达载体以及被泛素化的潜在目的蛋白表达载体（分别带有不同标签）进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析，这时常常会考虑泛素之间的连接位点，如K48位多泛素连接，就会在构建泛素表达载体时，把泛素短肽当中除K48位以外的所有其他赖氨酸位点都突变为精氨酸，我们把这种表达载体为泛素化位点特异性表达载体，类似的位点特异性表达载体还有K63、K11、K27、K29等不同位点特异性泛素表达载体。

当然，也会只单单把泛素短肽当中可能进行多泛素化连接的位点（如K48、K63、K11、K27、K29等不同位点）突变为精氨酸（Arginine，R），以干扰在这个位点进行多泛素化连接，这样就可以更清楚某一个位点进行多泛素化连接的作用。

化学生物学中的蛋白质合成与修饰蛋白质是生物体内最重要的大分子物质之一，参与了生物体内几乎所有的生命过程。

蛋白质的合成与修饰是化学生物学领域的一个重要研究课题。

本文将从蛋白质合成的基本过程入手，探讨蛋白质的合成和修饰在生物学中的重要作用。

一、蛋白质合成的基本过程蛋白质合成是指将氨基酸按照特定的序列连接起来形成多肽链的过程。

蛋白质的合成主要通过翻译过程完成，包括三个主要步骤：转录、转运和翻译。

1. 转录转录是指将DNA模板转录成RNA的过程。

在细胞质中，核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）起着重要的作用。

在核内，DNA的两条链解旋，其中一个链作为模板合成RNA。

通过与氨基酸配对，RNA链合成一条辅助的RNA链，称为mRNA（信使RNA）。

mRNA包含了氨基酸顺序的编码信息。

2. 转运转运是指将mRNA分子从细胞核转移到细胞质的过程。

mRNA通过核孔复合体运输到细胞质，并在细胞质中定位到核糖体上。

3. 翻译翻译是指通过核糖体将mRNA上的信息转化成氨基酸序列的过程。

翻译过程中，mRNA的信息通过转移RNA（tRNA）上的三个碱基序列（编码子）被翻译成相应的氨基酸。

tRNA携带相应的氨基酸，通过与mRNA的编码子配对，使氨基酸按照指定的顺序连接起来，最终形成多肽链或蛋白质。

二、蛋白质修饰的重要作用蛋白质合成完成后，往往还需要经过多种修饰过程才能发挥其生物学功能。

蛋白质修饰是指通过化学反应在蛋白质分子上加上一些功能团或改变其磷酸化状态、甲基化状态等方式，以改变蛋白质的物理化学性质和功能。

1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是蛋白质最常见的一种修饰方式。

通过磷酸化修饰可以改变蛋白质的电荷性质和空间构象，进而调控蛋白质的功能。

蛋白质的磷酸化修饰通常由激酶和磷酸酶等酶催化完成。

2. 甲基化修饰甲基化修饰是指在蛋白质上加上一个甲基团，常常通过甲基转移酶催化完成。

甲基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、DNA结合能力和互作能力，对基因表达和细胞生命活动起着重要的调节作用。

蛋白质修饰的研究方法人类基因组包含23,000个基因，然而，这些基因产生了显著更大的蛋白质组。

这是由于在转录后和翻译后水平的多样性。

单个基因在转录后，可以通过可变剪接，偶尔通过RNA编辑，产生多个mRNA分子。

许多蛋白质在翻译后，通过蛋白质修饰和/或蛋白质剪切，产生成熟的和功能型的形态。

通过广泛的翻译后修饰，蛋白质的结构和功能就多样性了。

简介相比于基因组包含的全部基因，人类蛋白质组包含了更多的功能性多肽，部分归因于，翻译的同时和翻译后的蛋白修饰（图1A）。

蛋白质组学研究的目的是获得存在于特定的细胞或组织类型，和存在于健康或患病组织的功能蛋白质的全貌。

蛋白质组学研究的重要领域之一，是识别那些翻译后修饰的蛋白质，及其修饰位点，确定修饰的功能以及在细胞功能网络中修饰蛋白的相互作用。

[放大]图 1.蛋白质修饰.A, 翻译后修饰，以及可变剪接，在从单一基因生成多种功能蛋白的过程中发挥重要作用。

B, 翻译后修饰，作为细胞内信号（磷酸化），蛋白稳定性的调控（泛素），转录调控（组蛋白乙酰化和甲基化），细胞表面信号（糖基化）等多种多样的细胞功能中发挥重要作用。

在过去的几十年，开发了多种方法测定蛋白质修饰。

在这里，我们重点介绍识别蛋白质修饰的一般方法，质谱；识别磷酸化的特异性方法，磷酸盐标记；识别泛素化的方法；在染色质重塑过程中识别组蛋白乙酰化和甲基化的方法；识别蛋白质糖基化的方法（表1和图1B ）。

详细的实验步骤以后将会整理归纳。

修饰 功能检测泛素化 蛋白质降解 •质谱• 泛素化检测糖基化 细胞外信号转导 • 质谱•高效液相色谱法 表格 1. 蛋白质修饰的类型，其主要的细胞功能，和主要的研究方法。

初步识别新的修饰位点的一个主要方法是计算机分析。

已经广泛应用计算机程序根据蛋白质的氨基酸序列识别假定修饰位点，这不是本文的讨论范围。

计算机程序的概述见Liu and Li, 2011 [1] 。

质谱在过去20年来，质谱分析已成为确定蛋白质修饰类型和位点的必不可少的工具。

蛋白质修饰‎的研究方法‎人类基因组‎包含23,000个基‎因，然而，这些基因产‎生了显著更‎大的蛋白质‎组。

这是由于在‎转录后和翻‎译后水平的‎多样性。

单个基因在‎转录后，可以通过可‎变剪接，偶尔通过R‎N A编辑，产生多个m‎R NA分子‎。

许多蛋白质‎在翻译后，通过蛋白质‎修饰和/或蛋白质剪‎切，产生成熟的‎和功能型的‎形态。

通过广泛的‎翻译后修饰‎，蛋白质的结‎构和功能就‎多样性了。

简介相比于基因‎组包含的全‎部基因，人类蛋白质‎组包含了更‎多的功能性‎多肽，部分归因于‎，翻译的同时‎和翻译后的‎蛋白修饰（图1A）。

蛋白质组学‎研究的目的‎是获得存在‎于特定的细‎胞或组织类‎型，和存在于健‎康或患病组‎织的功能蛋‎白质的全貌‎。

蛋白质组学‎研究的重要‎领域之一，是识别那些‎翻译后修饰‎的蛋白质，及其修饰位‎点，确定修饰的‎功能以及在‎细胞功能网‎络中修饰蛋‎白的相互作‎用。

[放大]图 1.蛋白质修饰‎.A, 翻译后修饰‎，以及可变剪‎接，在从单一基‎因生成多种‎功能蛋白的‎过程中发挥‎重要作用。

B, 翻译后修饰‎，作为细胞内‎信号（磷酸化），蛋白稳定性‎的调控（泛素），转录调控（组蛋白乙酰‎化和甲基化‎），细胞表面信‎号（糖基化）等多种多样‎的细胞功能‎中发挥重要‎作用。

在过去的几‎十年，开发了多种‎方法测定蛋‎白质修饰。

在这里，我们重点介‎绍识别蛋白‎质修饰的一‎般方法，质谱；识别磷酸化‎的特异性方‎法，磷酸盐标记‎；识别泛素化‎的方法；在染色质重‎塑过程中识‎别组蛋白乙‎酰化和甲基‎化的方法；识别蛋白质‎糖基化的方‎法（表1和图1‎B ）。

详细的实验‎步骤以后将‎会整理归纳‎。

修饰 功能检测泛素化 蛋白质降解‎ ∙质谱∙ 泛素化检测‎糖基化 细胞外信号‎转导 ∙ 质谱∙高效液相色‎谱法 表格 1. 蛋白质修饰‎的类型，其主要的细‎胞功能，和主要的研‎究方法。

初步识别新‎的修饰位点‎的一个主要‎方法是计算‎机分析。

蛋⽩修饰分析流程#流程⼤放送#蛋⽩质修饰分析流程1.背景和意义由mRNA表达产⽣的蛋⽩质需要经过蛋⽩质翻译后的化学修饰，即蛋⽩质修饰，来完成蛋⽩质的特定功能。

化学修饰会引起蛋⽩质的结构和理化改变，进⽽引起蛋⽩质的活性和功能改变。

蛋⽩质修饰包括磷酸化、⼄酰化、糖基化等，是调节蛋⽩质功能的重要⽅式。

例如，蛋⽩质的磷酸化与细胞信号传导、细胞周期调节、⽣长发育以及癌症机理等诸多⽣物学问题具有密切关系；蛋⽩质的⼄酰化是调节蛋⽩质活性的⼀种重要⽅式；蛋⽩质的糖基化对蛋⽩质的三维结构和功能具有重要影响；蛋⽩质的棕榈化对于跨膜蛋⽩质的活性具有重要的调节作⽤；蛋⽩质的硝基化和亚硝基化在蛋⽩质的氧化损伤⽅⾯具有重要作⽤。

因此，对蛋⽩质修饰进⾏详细分析对阐明蛋⽩质的功能具有重要意义。

2. 使⽤范围：细胞信号传导、细胞周期调节、⽣长发育，氧化机制研究，肿瘤与癌症机理研究等。

3.分析步骤：1.找到特定蛋⽩对应的序列⽂件根据蛋⽩质的名称，找到蛋⽩质组中的特定蛋⽩对应的序列⽂件，下载后进⾏后续数据处理，序列下载可⽤⽹站包括NCBI、EBI等。

2.预测蛋⽩质的磷酸化位点、⼄酰化位点和糖基化位点对蛋⽩质组学得到的重要蛋⽩质，进⾏功能位点预测，找到其中可能的磷酸化、⼄酰化、糖基化位点。

磷酸化位点预测对应的软件包括GPS、PhosphoSitePlus等，⼄酰化位点预测对应的软件包括ASEB、NetAcet等，糖基化位点预测对应的软件包括NetNGlyc、DictyOGlyc等。

图1. 预测得到的蛋⽩质磷酸化位点，包含磷酸化的位置、长度和打分信息。

图中红⾊标识的残基为特定蛋⽩中具有磷酸化作⽤的残基位点。

图2. 对于特定蛋⽩预测得到的蛋⽩质N末端的⼄酰化位点，包含⼄酰化的残基名称和打分信息。

图3. 对特定蛋⽩质预测得到的糖基化位点，包含蛋⽩质各个位置的糖基化可能性以及阈值。

3.预测蛋⽩质的棕榈酰化位点、硝基化位点和亚硝基化位点对蛋⽩质进⾏功能位点预测，找到其中可能的棕榈化、硝基化、亚硝基化位点。

peg修饰蛋白实验步骤
摘要：
1.实验目的
2.实验材料
3.实验步骤
4.结果分析
5.实验结论
正文：
一、实验目的
本实验旨在研究PEG 修饰蛋白的实验步骤，以期为相关领域的研究提供参考和借鉴。

二、实验材料
1.PEG（聚乙二醇）
2.蛋白质样品
3.缓冲液
4.实验仪器：离心机、分光光度计等。

三、实验步骤
1.准备蛋白质样品：选取适当的蛋白质样品，并确保其纯度。

2.PEG 的溶解：将PEG 加入到缓冲液中，充分搅拌，使其充分溶解。

3.PEG 修饰蛋白质：将蛋白质样品与PEG 溶液混合，置于适当的温度下，让两者充分反应。

4.分离与纯化：反应完成后，利用离心机将混合物进行离心，收集上清液，再通过分光光度计检测蛋白质的浓度。

5.结果分析：对实验结果进行分析，计算修饰率等指标。

四、结果分析
通过实验数据的分析，得出PEG 修饰蛋白质的修饰率、纯度等相关指标。

蛋白修饰研究策略分析（三）丨蛋白修饰的检测当大家通过前面两部分介绍的方法确定了与自己研究相关的某个蛋白的某一种修饰或某一个蛋白修饰的位点，那接下来肯定要对这种修饰或者这个位点进行检测。

下面根据不同的修饰类型、检测目的和检测试剂的情况，介绍一下常见的检测方法，通常用到的方法可分为直接免疫印迹分析、免疫沉淀-免疫印迹分析和过表达后再进行免疫沉淀-免疫印迹分析几种情况。

直接免疫印迹分析当所研究的蛋白修饰或修饰位点是已知的或被报道过，并且已经有了位点特异性商品化抗体，只要在一定的刺激条件下或建立某一种疾病动物模型，收集足量的细胞或组织进行裂解，获取蛋白提取物，再利用修饰位点特异性抗体进行WB分析即可。

由于很多常见的磷酸化位点特异性抗体开发的相对比较多，所以这种方法最适合磷酸化的检测。

当然，部分乙酰化和甲基化位点特异性抗体也有一些被开发出来，大大便利了大家的研究。

利用这种方法进行WB检测的时候，常常需要在检测某一种蛋白磷酸化位点的同时，对这种蛋白的总表达水平也做一个检测作为对照，以衡量不同组别蛋白磷酸化水平的差异。

示例结果如下：但如果自己所研究的位点还没有特异性抗体，那就需要进行修饰位点特异性抗体的定制，或需要考虑下面的替代方法了。

免疫沉淀-免疫印迹分析在一定的刺激条件下或建立某一种疾病动物模型，收集足量的细胞或组织进行裂解，获取足量蛋白提取物，利用目的蛋白特异性抗体进行免疫沉淀，然后把沉淀得到的蛋白进行SDS-PAGE/免疫印迹，利用修饰泛抗体进行免疫杂交，通过WB结果观察条带的情况。

在本系列推文（一）《蛋白修饰位点的鉴定或筛查》我们介绍了很多CST生产的修饰泛抗体，都可以用于这样的分析。

示例结果如下：这种方法说起来容易，但做起来并不容易获得理想的结果。

因为某种蛋白发生修饰是在一定的刺激条件下才会发生，而且带有修饰的蛋白所占比例是很低的，这就需要在实际操作当中必须确定合适的诱导修饰发生的条件，并保证进行免疫沉淀的蛋白总量足够多，以获取足量的目的蛋白，才有可能直接检测到目的蛋白的某一种修饰。

翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析蛋白质的翻译后修饰（Post Translational Modifications, PTMs）是蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程。

翻译后修饰蛋白质组是指细胞或组织等整体水平上的翻译后修饰蛋白质。

目前，已知的蛋白质翻译后修饰主要包括糖基化、磷酸化、酰化、泛素化、二硫键配对、甲基化和亚硝基化等等。

代谢组是细胞、组织或生物体内的小分子（通常称为代谢物）的整体水平。

翻译后修饰蛋白质可以调节细胞生物过程、影响机体的代谢变化。

影响代谢的翻译后修饰蛋白质不仅包括翻译后修饰转录因子，还包括翻译后修饰代谢酶。

因此，整合分析翻译后修饰蛋白质组和代谢组，比较它们的表达异同，有利于从不同层面解析生物的代谢机制，挖掘差异修饰蛋白质、代谢物、及它们参与的重要通路和相关基因，以进行后续深入研究。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，将磷酸化/糖基化/泛素化/乙酰化/甲基化/二硫键/亚硝基化等翻译后修饰鉴定服务，多种样品靶向和非靶向代谢组学分析服务，结合可定制化的生物信息学分析方法进行整合，为广大科研工作者提供基于质谱的翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析服务。

翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程。

应用领域农林领域：抗逆胁迫机制，物种保护研究等；畜牧业：致病机理研究，肉类及乳制品品质研究等；海洋水产：渔业环境与水产品安全等；微生物：致病机理，耐药机制，病原体-宿主相互作用研究等；生物医药：生物标志物，疾病机理机制，疾病分型，药物开发，个性化治疗等；环境科学：发酵过程优化，生物燃料生产，环境危害风险评估研究等；食品科学：食品储藏及加工条件优化，食品组分及品质鉴定，食品安全监检测等。

中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中/英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。

组蛋白修饰测序流程英文回答：Histone Modification Sequencing.Histone modification sequencing, or ChIP-seq, is a powerful technique used to study the role of histone modifications in gene regulation and other cellular processes. By combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) with high-throughput DNA sequencing, ChIP-seq allows researchers to identify the specific genomic regions where particular histone modifications are present.The general protocol for ChIP-seq involves thefollowing steps:1. Crosslinking: Cells are crosslinked with formaldehyde to preserve chromatin structure.2. Chromatin fragmentation: The crosslinked cells arelysed and the chromatin is fragmented into small pieces using sonication or enzymatic digestion.3. Immunoprecipitation: The fragmented chromatin is immunoprecipitated using an antibody specific to the histone modification of interest.4. Library preparation: The immunoprecipitated DNA is converted into a sequencing library using standard protocols.5. Sequencing: The DNA library is sequenced using a high-throughput sequencing platform.6. Data analysis: The sequencing reads are aligned to the genome and analyzed to identify the regions of DNA that are enriched for the histone modification of interest.ChIP-seq has a wide range of applications, including:Identifying the genomic targets of specific histone modifications.Studying the dynamics of histone modifications during development or in response to environmental cues.Correlating histone modifications with gene expression patterns.Identifying candidate genes and regulatory elements.中文回答：组蛋白修饰测序。

翻译后修饰蛋白组分析蛋白质翻译后修饰（PTMs）是指蛋白质在翻译中或翻译后的化学修饰过程。

蛋白质翻译后修饰（PTMs）通过给蛋白质添加磷酸酯，乙酸酯，酰胺基或甲基等官能团增加蛋白质组的功能多样性，并影响正常细胞生物学和发病机理的几乎所有方面。

蛋白质翻译后修饰在许多细胞过程中起着关键作用，如细胞分化、蛋白质降解、信号传导和调节过程、基因表达调节以及蛋白质相互作用。

蛋白质翻译后修饰PTMs通常包括磷酸化，糖基化，泛素化，亚硝基化，甲基化，乙酰化，脂质化和蛋白水解。

因此，PTM的特征（包括修饰类别和修饰位点）在细胞生物学以及疾病诊断和预防研究中至关重要。

蛋白质翻译后修饰（PTMs）受许多因素影响，鉴定过程比较繁琐。

例如：大多数翻译后修饰水平很低。

因此，在鉴定之前必须对修饰蛋白进行富集。

此外，修饰的稳定性以及质谱的检测效率也是PTMs分析过程中的关键因素。

百泰派克生物科技搭建有高级的分析平台，可用于表征各种翻译后修饰（PTM）。

BTP-蛋白质翻译后修饰鉴定能够解决的生物学问题百泰派克公司采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，为广大科研工作者提供磷酸化/糖基化/泛素化/乙酰化/甲基化/二硫键/亚硝基化等翻译后修饰鉴定。

蛋白质氨基酸序列的特定位置可以与化学基团或者小分子量的蛋白共价结合从而发生蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)，相较于没有发生修饰的蛋白，PTMs会导致特定序列分子量的增加。

在蛋白翻译后修饰方式的鉴定过程中，蛋白会首先被酶切成肽段，然后进入质谱进行分析；通过质谱分析，得到的是一系列肽段的分子质量信息。

对于某一个特定肽段而言，在没有发生任何翻译后修饰的情况下，其序列信息和分子量是确定的；蛋白质翻译后修饰方式鉴定示意图当它发生了某种翻译后修饰之后，例如磷酸化修饰，由于序列信息和分子量是确定的，磷酸根的分子量也是确定的；在质谱检测过程中发现其中的部分肽段的分子量刚好增加了一个磷酸根的分子量，假设这个肽段就发生了磷酸化修饰，再通过二级质谱图进行二次确认。