Blasticidin S使用方法及应用

农用抗生素类型及在现代农业生产中的应用作者：任兴超来源：《安徽农业科学》2014年第17期摘要农用抗生素属于生物农药范畴，因其安全、高效、低毒、无残留的特点，作为无公害果菜、绿色食品的首选安全农药使用。

农用抗生素按其防治对象可分为细菌病害、真菌病害、病毒病、杀虫杀螨、除草和植物生长调节剂6类，广泛应用于防治蔬菜、果树、粮棉等病、虫、草害，以及作为植物生长调节剂来使用，提高作物产量和解除药害。

关键词农用抗生素；高效；低毒；无残留；防治病虫草害中图分类号 S432.2+6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05465-02农用抗生素是在20世纪40年代医用抗生素发展的基础上研究开发的。

我国从20世纪50年代开始研究发展农用抗生素，70年代后尤其进入21世纪得到了较快发展[1]。

具有天然结构的抗生素有6 500种以上，其中5 000种以上是由微生物产生的。

目前，农用抗生素的应用涵盖了杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀病毒剂、除草剂及植物生长调节剂等农药所有领域[2]。

因农用抗生素易被土壤微生物分解，而不污染环境，对人畜安全，选择性高，适合现代农业对农作物病、虫、草害防治的技术要求，尤其是在发展无公害果菜、绿色食品中，农用抗生素更是作为首选安全农药来使用。

1 农用抗生素的概念及类型1.1 农用抗生素的概念农用抗生素是由微生物产生的天然化合物。

农用抗生素的来源主要是土壤微生物，目前开始从高等植物中提取，或从地衣、藻类、被子植物和各种海洋生物中寻找新的抗生素。

农用抗生素是指由微生物生命活动过程中产生的，对植物病原菌、害虫、螨类、线虫、有害植物（杂草）等其他生物，能在很低浓度下显示特异性药理作用的天然有机物，统称为农用抗生素（简称农抗）。

农用抗生素属于生物农药，亦称作微生物源化学农药。

无论细菌、真菌、放线菌都能产生农用抗生素，但主要是由放线菌产生的，约占2/3以上。

农用抗生素目前作为高效、低毒、无残留的生物农药广泛使用，在农作物病、虫、草害综合防治中发挥越来越重要的作用[3]。

农用抗生素一、农用抗生素概述要了解农用抗生素不得不从抗生素开始，我们都离不开抗生素，列举常用抗生素。

抗生素的发现是人们研究微生物拮抗关系的结果，微生物在其生活环境中常分泌一些物质，与其它微生物发生寄生作用、竞争作用和抗生作用。

目前，虽然已有人工化学合成的抗生素和从高等动植物组织中提取的抗生素，但是抗生素的最主要来源仍然是微生物。

细菌、放线菌和真菌都是能产生抗生素，其中尤以放线菌最为突出，它所产生的抗生素种类最多，实用价值也最大。

随着抗生素事业的不断扩大，除了医疗用途外，抗生素在农业上的应用也获得迅速发展，特别是50年代以来，由于公共卫生和环境保护的要求，使高效、低毒、无残毒的农用抗生素，作为植物保护剂的要求不断增长，受到世界各国的普遍重视，成为当代微生物农药研究工作中迅速发展的一个重要方面。

1.农用抗生素的概念抗生素antibiotics在日常生活中早已为人们所熟知，它是青霉素、链霉素、土霉素、卡那霉素等一类物质的总称。

它是由微生物生命活动过程中所产生的一类特殊的次生代谢产物。

微生物产生的次生代谢产物实际上包括很多小分子化合物，如抗生素、色素、生物碱、毒素等。

而抗生素是其中具有特异性抗菌作用的一类次级代谢产物，即在有效浓度很低的情况下，通过生物化学的作用，能够选择性地抑制某些生物的生长和代谢活动，甚至杀死它们，而对产生菌本身则没有或很少有影响的一种化学物质。

在不同的研究时期，不同的学科，抗生素有不同的含义。

早在1942年，美国学者Waksman曾给抗生素下过这样的定义：“抗生素是微生物在新陈代谢过程中产生的、具有抑制它种微生物生长或代谢作用的化学物质。

”但是随着抗生素研究工作的进展和领域的日益扩大，上述抗生素的定义显然就很难确切地概括抗生素这个名词的含义了。

所以，随着对抗生素认识逐步深化，人们对抗生素这个术语也曾一再做过补充和修改，但是，由于抗生素牵涉到很多学科和领域，所以它的定义应该从各种角度来考虑。

农用抗生素——是指由微生物发酵产生，具有农药功能用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次生代谢产物。

包括：井冈霉素、宁南霉素、申嗪霉素、阿维菌素、多杀菌素、乙基多杀菌素等；农用抗生素实际上是介于生物农药和化学农药之间的一大类重要的特殊农药。

农用抗生素是随着医用抗生素的发展而发展起来的，它的研发始于美国、英国和日本等国的科学家首先尝试应用链霉素和土霉素等来防治植物病害。

1958年,日本科学家Takeuchi等从灰色产色链霉菌中成功分离灭瘟素-S（Blasticidin-S）；1961年，日本开始大面积使用灭瘟素-S制剂防治水稻稻瘟病，基本上取代了有机汞制剂的使用，这一成果标志着农用抗生素正式进入植物保护领域。

继灭瘟素-S之后，日本科学家又相继开发了春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素(Polyoxins)和有效霉素(Validmycin)等一系列高效低毒的新型农用抗生素。

我国从20世纪50年代开始农用抗生素的研究，直到70年代才逐渐取得较大突破，研制成功并在生产上推广应用的农用抗生素主要有井冈霉素（Jinggangmycin）、多抗菌素(Polyoxins)、春雷霉素等10多个品种，其中，井冈霉素已经成为全世界生产规模和应用面积最大的农用抗生素。

农用抗生素按照防治对象可分为杀菌剂、杀虫剂、除草剂、防鸡球虫剂和杀鼠剂；我国目前登记的农用抗生素品种和数量占整个生物农药总数的70%，是农作物病虫害生物防治的主力军。

农用抗生素的种类 我国已登记的农用抗生素共有20种，大多为链霉菌所产生的代谢产物。

2011年，在我国重要农作物病虫害防治中，推广示范面积超过万亩的农用抗生素分别是：井冈霉素、阿维菌素、春雷霉素、多抗霉素、链霉素、多杀霉素、宁南霉素和武夷菌素。

除此之外，我国已研究开发或正在研发的抗生素还包括杀菌剂：四霉素、庆丰霉素（Qingfengmycin）、那他霉素(Natamycin)、灭粉霉素（Mildiomycin）、长川霉素（Ascomycin）、新奥苷肽（Xinaogantai）、捷安肽素（Jiean-peptide）；杀虫/螨剂：南昌霉素(Nanchangmycin)、梅岭霉素(Meilingmycin)、戒台素（Jietacin）、多拉菌素（Dolamectin）、米尔贝霉素(Milbemycins)，其中，米尔贝霉素在欧美和日本等多个国家已登记为高效低毒的杀螨剂。

BLAST使用方法一、BLAST的安装和准备工作2.获取待比对的序列文件，可以是FASTA格式的DNA或蛋白质序列。

二、BLAST的常用参数和选项1. Program：指定使用哪种BLAST程序（如BLASTn、BLASTp等）。

2. Database：指定使用哪个数据库进行比对。

3. Query：指定待比对的序列文件。

4. E-value：期望值。

一种描述比对结果误差率的指标，值越小表示结果越可信。

通常情况下，E-value小于0.01被认为是显著结果。

5. Word size：BLAST在比对时使用的核心词的长度。

长度越大表示查全率（sensitivity）越高，但速度会减慢。

6. Gap open：允许在比对过程中插入空位（如插入一个碱基）。

Gap open参数定义了开放一个空位的惩罚分数。

7. Gap extension：允许空位的延伸。

Gap extension参数定义了延伸一个空位的惩罚分数。

三、使用BLAST进行比对1.命令行方式：-打开命令行界面，并定位到BLAST软件的安装目录。

- 输入命令，指定BLAST程序、数据库、查询文件和其他参数。

例如：blastn -db nt -query query.fasta -out output.txt -evalue 0.01-运行命令，BLAST将开始进行比对并生成结果文件。

2.网页方式（以NCBIBLAST为例）：- 打开NCBI网站的BLAST页面（）。

-选择需要使用的BLAST程序（如BLASTn、BLASTp等）。

-上传待比对的序列文件，或者粘贴序列文本到输入框中。

-选择适当的数据库和其他参数。

-点击“BLAST”按钮，等待比对完成。

四、解读BLAST结果1. E-value：表示在随机比对中获得与查询序列相似度更高的结果的期望概率。

E-value越小表示比对结果越显著。

2. Bitscore：用于表示比对结果的质量。

Bitscore越高表示比对结果越可信。

分子量458.9溶解性（25°C）DMSO分子式C17H26N8O5.HCl Water ≥ 10 mg/mLCAS号3513-03-9Ethanol储存条件3年 -20°C 粉末状生物活性Blasticidin S hydrochloride是一种从Streptomyces griseochromogenes中分离的核苷抗生素。

灭瘟素S属于抗生素，具有真菌属性，通过研究肽键的形成，可以抑制细菌和真核生物体内蛋白质合成，并且可以有效防止稻瘟病病。

Blasticidin S (BlaS)灭瘟素S常被用作含有抗癌基因bls, bsr, or BSD癌变细胞的选择性试剂。

不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表（数据来源于FDA指南）小鼠大鼠兔豚鼠仓鼠狗重量 (kg)0.020.15 1.80.40.0810体表面积 (m)0.0070.0250.150.050.020.5K系数36128520动物 A (mg/kg) = 动物 B (mg/kg) ×动物 B的K系数动物 A的K系数例如，依据体表面积折算法，将白藜芦醇用于小鼠的剂量22.4 mg/kg 换算成大鼠的剂量，需要将22.4 mg/kg 乘以小鼠的K系数（3），再除以大鼠的K系数（6），得到白藜芦醇用于大鼠的等效剂量为11.2 mg/kg。

参考文献Critical role of the proton-dependent oligopeptide transporter (POT) in the cellular uptake of the peptidyl nucleoside antibiotic, blasticidin S.Kitamura K, et al. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Feb;1864(2):393-398. PMID: 27916534.Crystal and molecular structure of the antibiotic blasticidin S hydrochloride pentahydrate.Swaminathan V, et al. Biochim Biophys Acta. 1981 Oct 27;655(3):335-41. PMID: 7284390.Blasticidin S hydrochloride 目录号M9163化学数据2mmmm m。

第三章抗生素农药抗生素农药是随着医用抗生素的发展而发展起来的一类生物农药，至今不过40 多年的历史。

1958 年日本研究人员筛选出灭瘟素(Blasticicdin S)，用于防治稻瘟病，收到显著效果。

随后相继筛选出春日霉素(Kasugamycin) 、多氧霉素( Polyoxins) 、有效霉(VaIidamycin) , 都有较大批量的生产，近几年俄罗斯、美国、日本、匈牙利、意大利、印度和丹麦等国, 都已把农用抗生素的研究列入国家重点规划。

我国是农用抗生素生产大国和应用大国, 也是农用抗生素研究开展较早的国家。

早在20 世纪50年代就已开始研究, 只是步履缓慢, 到70 年代以后才取得了很大的进展。

相继成功开发了井冈霉素、春雷霉素、农抗120、多抗霉素、灭瘟素、公主岭霉素、浏阳霉素、莫能霉素, 以及植物生长调节剂赤霉素。

由于国家的大力支持, 近年来我国农用抗生素事业在较短的时期内取得了迅速的发展, 已成为我国作物保护工作上的一项重要措施。

第一节抗生素农药概述一、抗生素农药分类1、抗生素的定义抗生素（antibiotics）这个名词，在日常生活种早已为人们所熟悉，它是青霉素、链霉素、土霉素、卡那霉素等一类化学物质的总称。

农用抗生素系指微生物生命活动过程中产生的可用于防治农业有害生物的一类特殊的次级代谢产物。

微生物产生的次级代谢产物实际上包括了很多种，它们结构类型繁多、生理生化作用多样，如抗生素、色素、生物碱、毒素、生长因子、酶抑制剂等等。

而抗生素则是其中具有特异性抗菌杀虫作用的一类次级代谢产物，即在有效浓度很低的情况下，能够选择性地抑制某些生物的生长和代谢活动，导致其无法正常繁衍，甚至杀死它们，而对产生菌本身则没有或很少有影响的一类化学物质。

抗生素的定义随着生命科学的进展，在不断地发展。

早在1942年，美国学者Waksman 曾给抗生素下过这样的定义：“抗生素是微生物在新陈代谢过程中产生的、具有抑制其他微生物生长或代谢作用的化学物质。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail ：****************** 技术咨询：***************** 网址：碧云天网站 微信公众号Blasticidin S HCl (灭瘟素S)产品编号 产品名称包装 ST018-1ml Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg/ml ×1ml ST018-5ml Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg/ml ×5mlST018-10mg Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg ST018-50mgBlasticidin S HCl (灭瘟素S)50mg产品简介：Blasticidin S 是来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes )的一种核苷类抗生素，中文名为灭瘟素S 、杀稻瘟菌素S 或稻瘟散，一般为盐酸盐。

Blasticidin S 常用于筛选携带bsr /BSD /bls 基因(常标记为bsr r /bsd r /Blast r )质粒的哺乳动物稳定转染细胞株，具有快速而强效的作用模式，很低的抗生素浓度便能使未携带抗性基因的细胞迅速死亡。

本产品10mg/ml 包装配制在HEPES (pH7.4)缓冲溶液中，浓度为10mg/ml ，经0.22μm 滤膜过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

本产品10mg 和50mg 包装为粉末装。

Blasticidin S 通过干扰核糖体结合肽段而特异性抑制原核细胞或真核细胞的蛋白合成。

目前已经有3种灭瘟素耐受基因，一种是分离自链霉菌(Streptoverticillum sp.)的乙酰基转移酶基因bls ；另外两种是脱氨酶基因，分别是从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中分离的bsr 和从土霉菌(Aspergillus terreus )中分离的BSD 基因。

BLAST种类及使用方法BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是一种广泛使用的序列比对算法，可用于比较DNA，RNA或蛋白质序列的相似性。

它是生物信息学领域中最常用的工具之一，可以帮助研究人员识别新的序列，注释基因功能，鉴定物种间的进化关系等。

1.BLASTN：BLASTN用于比对DNA序列。

它可以将一个查询DNA序列与已知的DNA序列数据库进行比较，找到相似的序列。

BLASTN通常用于物种鉴定、基因组注释和寻找同源基因等方面的研究。

2.BLASTP：BLASTP用于比对蛋白质序列。

它可以将一个查询蛋白质序列与已知的蛋白质数据库进行比较，找到相似的蛋白质序列。

BLASTP 通常用于寻找同源蛋白质，预测蛋白质功能和结构，以及识别蛋白质家族等方面的研究。

3.BLASTX：BLASTX用于比对DNA序列与蛋白质数据库的比对。

它通过将DNA序列翻译成蛋白质序列，然后与已知的蛋白质数据库进行比对，找到相似的蛋白质序列。

BLASTX通常用于从未知的DNA序列中预测蛋白质编码区域，注释基因功能等方面的研究。

4. TBlastN：TBlastN用于比对蛋白质序列与DNA数据库的比对。

与BLASTX相反，TBlastN将已知的蛋白质序列与DNA数据库进行比对，找到相似的DNA序列。

TBlastN通常用于寻找蛋白质在基因组中的编码区域，确定启动子和转录因子结合位点等方面的研究。

5. TBlastX：TBlastX用于比对转录本与转录本数据库的比对。

它可以将一个查询转录本序列与已知的转录本数据库进行比对，找到相似的转录本。

TBlastX通常用于寻找新的转录本和预测基因表达模式等方面的研究。

使用BLAST有以下几个步骤：1.准备查询序列：将待比对的DNA、RNA或蛋白质序列准备成文本文件，确保序列格式正确，并确保序列长度适合比对任务。

2. 选择数据库：根据研究需求，选择适当的数据库。

blast matches方法
猜你想了解的是BLAST Matches方法，它是一种用于比对生物序列的算法。

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）全称是基本局部比对搜索工具，可用于数据库相似性搜索。

其主要步骤如下：
1. 打开BLAST，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST（blastn）”或“Search for short, nearly exact matches”。

2. 新页面完全显示后，将引物序列直接拷贝到“Search”框，可以通过以下3种方法进行拷贝：
- 直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面。

- 直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面。

- 直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列。

3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。

4. 查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。

如果有，则说明引物序列正确。

需要注意的是，上、下游引物的长度在查看Blast结果时有用。

你还可以查询BLAST 的官方网站，以获取更详细的信息和使用说明。

Zeocin博来霉素,博莱霉素使用方法Zeocin（博来霉素）和Blasticidin S（博莱霉素）使用方法一、概述Zeocin和Blasticidin S是常用的抗生素，用于细胞培养和基因转染实验中的选择标记和筛选。

二、Zeocin（博来霉素）使用方法⒈简介Zeocin是一种独特的抗生素，主要通过选择性杀死或抑制非转染的细胞株来筛选基因转染细胞株。

⒉配制按照瓶子上的指示，将Zeocin药物与适当的培养基一起配制。

⒊浓度选择在进行筛选之前，先进行一系列的药物浓度实验，以确定对特定细胞株的最佳浓度。

一般建议从20 μg/ml开始一步步减量，最终确定最佳浓度。

⒋感受性试验在进行筛选之前，可通过感受性试验来确定细胞株对Zeocin的敏感性。

在细胞培养皿上种植一系列浓度的细胞，观察细胞的生长情况并确定最佳浓度。

⒌筛选将转染细胞株接种在含有Zeocin的培养基中，培养一段时间。

观察细胞的生长情况，转染成功的细胞株将能够在Zeocin存在下正常生长，而未转染的细胞则无法生存。

⒍维持选择压为了保持转染细胞株的稳定性，需继续在培养基中添加适量的Zeocin。

三、Blasticidin S（博莱霉素）使用方法⒈简介Blasticidin S是一种抗生素，可抑制蛋白质合成过程。

在基因转染实验中常用于选择标记和筛选。

⒉配制按照瓶子上的指示，将Blasticidin S药物与适当的培养基一起配制。

⒊浓度选择在进行筛选之前，先进行一系列的药物浓度实验，以确定对特定细胞株的最佳浓度。

一般建议从5 μg/ml开始一步步增加，最终确定最佳浓度。

⒋感受性试验在进行筛选之前，可通过感受性试验来确定细胞株对Blasticidin S的敏感性。

在细胞培养皿上种植一系列浓度的细胞，观察细胞的生长情况并确定最佳浓度。

⒌筛选将转染细胞株接种在含有Blasticidin S的培养基中，培养一段时间。

观察细胞的生长情况，转染成功的细胞株将能够在Blasticidin S存在下正常生长，而未转染的细胞则无法生存。

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)NCBI采用的一套对蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具(当然很多其它生物学数据库都提供了BLAST检索入口)。

您只需提交您的序列，通过BLAST查询就顷刻间从公开数据库中无数的的序列里找到相似序列。

BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。

BLAST 采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。

如果您想进一步了解BLAST算法，您可以参考NCBI的BLAST Course ，该页有BLAST算法的介绍。

BLAST功能是什么？BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。

BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。

BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上发表的方法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。

从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对序列也考虑在内了。

BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。

所查询的序列和调用的数据库则可以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。

GCG及EMBOSS等软件包中包含有五种BLAST：1、BLASTP是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。

库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。

2、BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。

先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。

3、BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。

库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。

【关键字】精品NCBI中Blast种类及使用简介NCBI中Blast种类简介1．Blast Assembled Genomes在一个选择的物种基因组序列中去搜索。

2．Basic Blast2.1 nucleotide blast--- 用核酸序列到核酸数据库中进行搜索，包括3个程序2.1.1 Blastn----核酸序列（n）到核酸序列数据库中搜索，是一种标准的搜索。

2.1.2 megablast----该程序使用“模糊算法”加快了比较速度,可以用于快速比较两大系列序列。

可以用来搜索一匹ESTs序列和大的cDNA或基因组序列, 适用于由于测序或者其他原因形成的轻微的差别的序列之间的比较2.1.3 discontiguous megablast----与megablast不同的是主要用来比较来自不同物种之间的相似性较低的分歧序列。

2.2 Protein Blast2.2.1 Blastp ---蛋白质序列到蛋白质序列数据库中搜索，是一种标准的搜索。

2.2.2 psi-blast---位点特异迭代BLAST —用蛋白查询来搜索蛋白资料库的一个程式。

所有被BLAST发现的统计有效的对齐被总和起来形成一个多次对齐，从这个对齐，一个位置特异的分值矩阵建立起来。

这个矩阵被用来搜索资料库，以找到额外的显著对齐，这个过程可能被反复迭代一直到没有新的对齐可以被发现。

2.2.3 PHI-BLAST---以常规的表达模型为特别位置进行PSI - BLAST检索,找出和待查询序列具有一样的表达模型且具有同源性的蛋白质序列。

2.3 Translating BLAST2.3.1 blastx----先将待查询的核酸序列按6 种读框翻译成蛋白质序列,然后将翻译出的蛋白质序列与NCBI 蛋白质序列数据库比较。

2.3.2 tblastn-----先将核酸序列数据库中的核酸序列按6 种读框翻译成蛋白质序列,然后将待查询的蛋白质序列与翻译结果进行比较。

Blasticidin S（杀稻瘟菌素）
一些哺乳动物细胞的建议工作浓度：
操作步骤（哺乳动物稳转株筛选）
Blasticidin S通常使用浓度为10 μg/ml。

携带bsr或BSD基因的质粒转染到细胞中，在含有Blasticidin S的正常生长培养基中孵育，用于筛选稳定转染细胞株。

（1）转染后48h，用含有适宜浓度Blasticidin S的新鲜培养基将细胞传代（注：细胞处于活跃分裂期时抗生素工作最好。

细胞密度太高，抗生素效率降低。

细胞分盘时覆盖率最好不超过25%）；
（2）每3-4天去除培养基，加入含抗生素的新鲜培养基；
（3）7天后检测细胞集落形成。

根据宿主细胞种类和转染/筛选效率，集落形成可能需要增加一周或更久。

（4）转移5-10个耐受克隆到35mm细胞盘中，加入选择培养基维持培养7天。

随后用细胞毒性实验进行检测。

BlastNMegaBlastDiscontiguous MegaBlast 的区别与使⽤三者之间的共同之处就是BlastN/Mega blast/Discontiguous megablast 都是BlastN，就是核酸序列⽐对核酸序列的算法。

简单⽽⾔BlastN : 不那么灵敏，相似度较低的序列也可以查找到，所以⽐对的速度慢，但允许更短序列的⽐对（如短到7个碱基的序列）。

MEGABLAST : 采⽤贪婪式算法，速度较⼀般blast快，通常⽤于从数据库中查找⾮常相似的序列，运⾏速度快，灵敏度⾼。

同⼀物种间的。

Discontiguous MEGABLAST : 灵敏度更⾼，⽤于更精确的⽐对。

主要⽤于跨物种之间的同源⽐对。

详细解释1. MEGABLAST 常被⽤于鉴定核酸序列MEGABLAST is the tool of choice to identify a nucleotide sequence.MegaBLAST也是⼀种BLASTN程序，不过它主要是⽤来在⾮常相似的序列之间（来⾃同⼀物种）⽐对同源性的。

鉴定某⼀段核酸序列是否存在于数据库，最好的⽅法是选择MEGABLAST。

如果⽐对到的序列在数据库中注释完整的话，那该序列丰富的注释可以当作新序列的参考。

当然，BlastN/MEGABLAST/Discontiguous MEGABLAST，都可以完成这种事情。

但MEGABLAST就是特别设计⽤于⾮常相似序列之间的⽐对，可⽤于寻找查询序列的最佳匹配的序列。

2. Discontiguous MEGABLAST 更好地⽤于查找不同物种的相似的核酸序列，⽽不是与查询序列相同物种的。

Discontiguous MEGABLAST is better at finding nucleotide sequences similar, but not identical, to your nucleotide query. Discontiguous MEGABLAST，⽤于跨物种核酸序列快速⽐对。