多模式活体探针研究--做探针研究到底做些什么
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课题题目：用于脑胶质瘤靶向示踪的磁共振/光声多模态纳米探针
课题的目的，意义和研究状况:
胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，约占所有颅内肿瘤的46%。
胶质瘤具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等特点，成年人胶质瘤5年生存率不足5%。
脑胶质瘤往往呈浸润性生长，导致与正常脑组织的界限模糊从而给手术切除带来很大的困难。
脑肿瘤的不完全切除成为了现行手术治疗方案效果差，复发率高的主要原因。
因此对胶质瘤的术前精确定位成为了目前临床治疗面临的最紧迫需求。
磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）是现阶段用于脑胶质瘤无创定位的主要手段。
MRI虽然有很好的空间分辨率，但其较低的灵敏度及MRI造影剂循环时间短，无靶向性等缺点限制了其对胶质瘤的成像效果。
光声成像（Photoacoustic Imaging）是近年来发展起来的一种新型无损医学成像方法。
它结合了纯光学成像的高灵敏度和纯超声成像的高组织穿透能力优点，可以提供高灵敏度的深层组织影像。
另外，与小分子探针相比，基于纳米尺寸的探针具有循环时间可控，肿瘤被动靶向性好，及可多位点修饰等优点。
综合以上特点，本项目拟合成一类对脑胶质瘤具有靶向示踪性的磁共振/光声多模态纳米探针。
此探针不但可对脑胶质瘤边缘精确定位，还适用于影像指导下的肿瘤手术切除。
此项目的开展将不但有望提高脑肿瘤手术治疗效果和延长病人生存时间，同时在生物医学影像，分子功能成像等领域也将具有广泛的应用前景。
课题基本思路与主要内容:
基本思路：肿瘤血管受体靶向多模态
我们设计了如图一的目标及参比纳米探针Den-RGD及Den-PEG。
纳米探针中，树枝状高分子（Dendrimer）被选为纳米探针载体是因为其具有分子量单一，球状结构，活性基团众多且分布均匀，易标记等优点。
目标探针中，对肿瘤血管内皮
细胞高表达的整合素蛋白α
V β
3
受体具有高靶向性的c[RGDyK]环肽将通过聚二
乙醇（PEG）桥链标记到探针载体上。
PEG不但可以提高探针的生物兼容性，还能使环肽靶向性免于载体空间位阻影响。
影像基团包括光声成像基团IR783，顺磁性基团Gd-DOTA及红色荧光基团罗丹明将直接标记到载体上（图1）。
目标纳
米探针对脑肿瘤靶向示踪将不但可以被磁共振和光声成像同时无创监测，探针的组织内分布及受体靶向性还可通过离体荧光显微镜成像加以证实。
与正常血管相比，肿瘤新生血管具有不规则，不成熟和高通透性等特征。
纳米探针可利用肿瘤新生血管同正常血管间通透性差异（enhanced permeability and retention, EPR effect）实现对肿瘤的被动靶向性。
为证实受体靶向性对肿瘤示踪的影响，参比探针PEG链上将不标记靶向环肽。
主要内容：
1. 目标和参比探针的合成与表征;
2. 离体细胞实验验证探针的受体靶向性及探针亚细胞分布，研究细胞光声信号强度与受体靶向性间的关系；
3. 活体动物磁共振及光声成像实验验证探针对胶质瘤的肿瘤示踪信噪比；
4. 离体组织成像验证探针的受体靶向性及生物分布。
实验方案：
图1. 纳米探针Den-RGD和Den-PEG的合成路线。
参比探针Den-PEG的合成：分别将罗丹明（rhodamine），IR783和聚乙二醇（PEG，2 kDa）的N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimidyl)在PH=8.3的缓冲溶液中与第五代的树杈状高分子（G5）反应得到中间体1。
其与DOTA-NHS反应得到化合物2。
2上的DOTA配体与碳酸钆配合得到参比探针Den-PEG。
目标探针Den-RGD的合成：双功能化聚乙二醇（NH2-PEG2k-Malemide）与琥珀酰亚氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯（SPDP）缩合制得中间体3。
3与树杈状高分子（G5）反应得到中间体4。
分别将Rhodamine-NHS，IR783-NHS和DOTA-NHS与中间体4
反应得到化合物5。
化合物5与Gd
2(CO
3
)
3
配合后与标记有巯基的RGD环肽缩合得
到目标纳米探针Den-RGD。
创新点：
1) 本项目首先提出可用于脑胶质瘤无创定位的磁共振/光声多模式纳米探针。
此类探针国内外的文献均未有报道。
2) 多位点标记在探针上的近红外荧光基团IR783可以同时实现荧光光学成像和光声成像。
另外罗丹明荧光基团可用于组织切片中对探针的显微镜示踪。
3) 通过对胶质瘤外周新生血管的靶向示踪可以回避探针跨血脑屏障的难题。
同时根据肿瘤边缘血管密集的特点，可充分发挥光声成像的优点，达到最佳的影像效果。
实验难点：
1) 在探针合成过程中，如何精确控制不同影像基团在探针载体上的标记数目从而将探针的分散度系数控制在最小的范围内；
2) 原位脑胶质瘤小鼠模型的建立是实验难点之一。
我们前期的工作中将人胶质瘤U87MG细胞移植入小鼠脑纹状体中得到了胶质瘤模型。
本工作将在成瘤时间，瘤体生长速度等方面进一步完善此模型。
3) 在图像处理方面将涉及到活体多模态图像间比较，融合及重建等方面的技术难题。
我们将通过与美国约翰霍普金斯大学放射学系的蒋露博士间的合作完成这一问题。
课题研究进展计划:
2011.5~2011.7：参比探针Den-PEG的合成
2011.7~2011.8：目标探针Den-RGD的合成
2011.9—2011.10 : 测量纳米探针的受体靶向性和成像参数。
2011.11—2012.3: 细胞实验，测定纳米探针在胶质瘤细胞株中的毒性，细胞内吞效率，胞内传递途径和最终亚细胞分布。
研究探针颗粒对整合素蛋白αVβ3受体高表达U87MG细胞的体外结合数。
