分子生物学试卷
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中南林业科技大学课程考试试卷课程名称：高级工业微生物遗传育种；考试时间：120分钟一、名词解释（每题3分，共18分）GMOs:Genetically modified organisms转基因作物：通过基因工程技术导入某种基因的植物、动物、微生物。
菌种退化:degeneration of spawn菌种突然或逐渐丧失原有的生活力和丰产性能的现象。
主要表现: 菌丝生长速度减缓,在培...经常注意选种育种，减少转接次数，改善保藏条件，可以有效地克服菌种的退化。
沉默突变:silent mutation当一种氨基酸的置换对于细胞的表型没有可检出的影响时就称为沉默突变。
转染:transfection外源性DNA(包括基因)掺入到真核细胞使之获得新的遗传物质的过程。
将被掺入的DNA片段经磷...现在研究真核基因表达就采用细胞转染的方法。
将真核DNA转染NIH3T3细胞后观察是否诱发细胞转化的方法，常用于检测某些癌基因。
质粒不亲和性: plasmid incompatibility 有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。
这样的两种质粒称为不亲和质粒.二、问答题（每题10分，共60分）1 简述遗传物质在各种微生物中的存在状态及复制方式。
微生物遗传的物质也是DNA 和RNA，具有一样的分子结构与功能，但微生物的遗传物质较其它生物的遗传物质具有多样性，不仅存在于其细胞染色体，而且在真核微生物中的细胞器中，染色体外的质粒，RNA病毒的RNA核酸，和无核酸的朊蛋白等都有遗传信息物质存在。
比较了三域微生物遗传物质的特性及其差异。
微生物DNA同样以半保留方式复制，以生物遗传表达的中心法则，即以DNA作模板转录为RNA,再由RNA翻译为蛋白质，并在酶量和酶活性两个层次上进行遗传表达的调控。
微生物可发生变异，这些变异是由于微生物的基因发生变异所引起的，基因发生突变的类型及其诱发因素是多样的。
同样，微生物具有对DNA损伤进行多种方式修复的能力。
2 根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂，为什么？不会，诱变的特异性是靠识别碱基对来进行的，而任一个基因都不可能有完全特异的碱基对供识别没有这种诱变剂因为从分子生物学的角度来看，所有的基因都是存在于DNA双链中，基因的信息都存在于由ATCG碱基对的排列顺序中。
即使有某些物质可以特异的识别某几个碱基的排列顺序，但这种排列也存在于其他基因之中，诱变是在整个基因组范围内发生的。
所以从现有的科研水平来看，不存在有特异性的理化诱变剂。
现在对基因的诱变可以通过传统的遗传学方法实现，可以构建带有诱变位点的基因载体，转入生物体中，达到特异诱变的目的3 何为菌种复壮？如何进行狭义的复壮:是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有性状的一种措施；广义的复壮:指在菌种的生产性能尚未衰退前，有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。
菌种的复壮措施：①纯种分离采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。
把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。
还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。
②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）；主要是对一些寄生性的菌株,可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内,提高其寄生性能及其它性能.③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。
可以采用各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留下群体中生长健壮的个体.如:对"5406"抗生菌的分生孢子进行-30-10度的低温处理5-7天,使80%死亡,在抗低温个体中可找到健壮的个体.④采用有效的菌种保藏方法。
4 何谓细菌的接合？F-因子有哪些特性？存在状态如何？bacterial conjugation 细菌通过细胞的暂时沟通和染色体转移而导致基因重组的过程。
细菌中导致基因重组的过程还有转化和转导。
这两个过程都不需要细菌细胞的直接接触，而且基因重组的范围更小，只限于更小的一段染色体片段和少数几个紧密连锁的基因大肠杆菌的性因子。
是一种质粒DNA分子，含有它的大肠杆菌为雄性菌株。
供体菌细胞中含有一种致育因子，称为F因子。
其在细菌的接合中起重要作用。
F因子的特性为可以促进供体菌向受体菌传递染色体DNA或质粒。
F因子决定编码的性菌毛可在供体与受体菌间形成交通通连接结构，从而可使两个杂交细菌间形成胞浆内连接桥。
F因子可以游离存在于胞浆内，也可与细菌染色体整合。
如果F因子游离存在于胞浆内，接合时仅F因子DNA可通过胞浆的连接桥进入受体菌。
然而F因子转移的特点为，从一个起始点开始，仅有一条DNA链进入受体菌，以后供体、受体菌分别以一条DNA链为模板，以滚环式复制另一条互补链，形成完整的双链F因子。
这一特性使F因子与其他能通过接合传递的细菌质粒一样，在细菌群体中传播，类似引起传染，即原来的F+菌仍为F+，而F-受体菌可变成F+菌。
F因子若游离于胞质中则为 F+ ，它和 F-进行结合杂交，结果是给、受体各含一个F因子（至于原因就不细说了）均成为F+ ；F因子若结合在给体染色体基因中，则称做高频重组菌株Hfr，它和F-进行杂交，结果是给、受体均成为F-。
另外，还有F`（F右上角是一撇）的概念，F`实际上就是携带有宿主染色体基因的F因子，F`和F-的杂交与F+和F-杂交的不同处是给体的部分染色体基因随F`一起转入受体细胞，并且不需要整合就可表达，实际上是形成一种部分二倍体，此时的受体细胞也就变成了F`。
5 什么是感受态？如何诱导产生？感受态细胞有什么特点？简述转化的过程及影响转化的因素。
细胞处于最适于摄取和容忍外来DNA的生理状态。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
感受态细胞特点为：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。
（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。
（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。
（4）受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。
（5）不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞6基因工程育种时，目的基因的获得途径鸟枪法这种方法类似于鸟枪发射散弹。
具体的做法是：用若干个合适的限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。
这些片段的长度相当于或略大于一个基因。
然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。
例如，当我们要提取维生素B1合成酶基因时，就要采用维生素B1的营养缺陷型细菌（它在不含维生素B1的培养基上不能生长）。
把整合了不同DNA片段的营养缺陷型细菌分别接种到不含维生素B1的培养基上进行培养，只有那些整合了含有维生素B1合成酶基因的DNA片段的细菌才能正常生长。
最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来，再进行一系列的操作，就可以获得维生素B1合成酶基因。
这种方法的缺点是专一性较差，分离出来的有时并非一个基因，但由于这种方法操作简便，所以现在仍然广泛采用。
反转录法这种方法是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。
这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。
氨基酸序列合成法这种方法是建立在DNA序列分析基础上的。
当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。
这种方法专一性最强，现在用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。
但是这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且必须事先把它们的核苷酸序列搞清楚。
对于许多复杂的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用这种方法合成，只能用前两种方法或其他方法分离或合成。
这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类需求。
因此，这一方法今后将随着技术的不断改进而得到越来越广泛的应用。
三、实验设计题（22分）用野生型的大肠杆菌为出发，可用哪种诱变剂怎样进行诱变得到Leu-突变株，如何检出和鉴定该突变株？1、稀释菌液，梯度铺板2、选取单菌落分明，菌落数在20-30个的平板3、在培养皿背面对每个菌落进行编号4、配置不含目的氨基酸的培养基，倒平板5、对上一步的平板，背面用marker笔划线分割成小格子，编号6、从第2步的平板上，挨个挑取菌种接种于营养缺陷平板上，要按背后的格子编号接种7、培养8、没长出来的，就有可能是营养缺陷型，按照编号从第二步平板上挑出来再次用本方法鉴定，确认。
1。
先要获得野生型大肠杆菌的纯培养物2。
诱变：可以选择各种诱变法，如紫外线诱变法，将一定浓度的菌液（可分成好几等分分别做实验）放在一定强度的紫外灯下照射，那分成的几等分可以分别照射10S，20S，30S，40S，50S，60S，注意，菌液不可太稀太浓，这个操作应该在黑暗的条件下进行，只允许有紫外光，以免光修复造成突变失败。
3.培养：将上述菌种分别涂抹在配好的完全培养基上（牛肉膏-蛋白胨培养基），倒置培养过夜4，筛选：配置好基本培养基，再往上面添加一定浓度的氨基酸营养液，除了不要添加你说要得到的营养缺陷的那种氨基酸，必需氨基酸都要添加，再用影印法将3中的菌落印到这些培养基上，倒置培养过夜。
5。
挑取：直接挑取4中培养基上的菌落，就是你要找的氨基酸营养缺陷突变菌株在2中，之所以要分成好几份做，再以不同时间长短去照射，是为了加大筛选的效率时间过短，可能得不到想要的突变菌种，而时间过长，菌株全死，也得不到想要的菌株，所以这样做也可以算是一个试验性的步骤！。
