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冰冻切片的免疫荧光

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免疫荧光通用操作规程
冰冻切片的免疫荧光
1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。

-20C保存3月，-80C长期保存。

请勿保存于液氮。

2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时
4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润
5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。

为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液
EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6, 室温封闭1 小时
封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白
7, 一抗4C过夜
请用封闭液稀释一抗
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14,干片后4C保存
石蜡切片的免疫荧光
1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块
2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,
切片复水：58 °C 20mi n-
xylene 2x10min-
100%EtoH2x10min
95%EtoH2x10min-
70%EtoH10min-, DDW5min
4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润
5，抗原修复过夜。

为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压. 微波
修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0，B 液EDTA-Na 缓冲液PH8.0，C 液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1 小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in IxPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子，无需封闭的蛋白
7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞
因子用1%BSA 封闭，同时一定要有一个阴性对照。

8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in 封闭液，避光
室
温1 小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DDW Rinse , DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14,干片后4C保存
备注：多重荧光染色原则
A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染
B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，
抗原修复 : O/N
第一个一抗：4C 0/N ,第二天对应二抗 @RT 1hr红光
短暂地封闭
第二个一抗：@RT 2hr,对应二抗@RT 1hr绿光
DAPI
封片
备注：对照实验
A: 阴性对照：组织免疫荧光必做
相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色
不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B :阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本
TUNEL 与免疫荧光共染时
细胞的免疫荧光
1,细胞生长贴壁到80%融合,倒掉细胞培养液
2, Rinse,用固定剂rinse —到两次
3, 首选4%多聚甲醛固定15min ,0.2%TritonX-100 打孔5-10min；
或者选用不同的固定方式：
甲醇（分析纯 or HPLC）-20C 10min 丙酮（HPLC）-20 C 10min
4%多聚甲醛 +0.2%TritonX-100 10min
4%多聚甲醛 +0.2%Saponins10min 细胞核核膜
4%多聚甲醛15min + -20 C甲醇5min细胞膜
4%多聚甲醛15min + -20 C丙酮5min细胞骨架/微管蛋白
4%多聚甲醛10min @RT+4 C 10min+ -20C甲醇1min细胞膜+胞浆蛋白+ 细胞核4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润
5, 室温封闭1 小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in IxPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS
6, 一抗4C过夜
请用封闭液稀释一抗
7, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
8, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in 封闭液，避光室
温1 小时
9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse
10, DAPI 染核5min，
11，DDW Rinse
12，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜13,干片后4C保存。

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免疫荧光法—冰冻切片

免疫荧光法—冰冻切片

免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。

冰冻切片免疫荧光染色步骤

冰冻切片免疫荧光染色步骤

冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤：
(1)冰冻切片取出，室
温放置使其干燥后，用冷丙酮于4C固定10分钟。

( 2)切片用
0.01MPBS清洗后加入
1.2%双氧水作用30 分钟，以除去非特异染色。

( 3)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

( 4)
0.3%Triton X-100作用30 分钟。

(5)加入以抗体稀释液(含1%BSA勺
0.01M PBS，pH
7.4)稀释至工作浓度的一抗，4C过夜。

( 6)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

(7)加入荧光抗体TRITC-lgG( 1: 100)或FITC-lgG( 1: 100),室温孵育2 小时。

( 8)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

( 9)缓冲甘油封片，荧光xx 下观察。

对照组:
采用空白对照:
除用
0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同载玻片处理步骤：（1 ）硫酸浸泡过夜。

（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3 遍。

（3）晾干后在
0.1%明胶中快速浸泡后取出。

室温晾干或37 C烤干备用。

冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程

冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

免疫荧光双染

免疫荧光双染

免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。