梅毒的实验室诊断

梅毒的实验室诊断引言：梅毒是由苍白密螺旋体苍白亚种(TP)感染所引起的一种慢性全身性性传播疾病，在中国，梅毒在大约50年前已经基本被消灭[1]。

同其他国家一样，近年来中国梅毒螺旋体感染的发病率呈逐年上升趋势，是目前中国主要的性传播疾病之一。

[2]。

早期主要表现为皮肤黏膜损伤，晚期将累及心血管中枢神经骨骼及眼部等重要脏器。

目前为了控制梅毒的医院感染，现已规定凡是手术、输血( 供、受血者) 及各种创伤性检查的患者，均进行梅毒螺旋体的相关血清学检查。

[3]一，梅毒螺旋体梅毒的病原体为梅毒螺旋体苍白密螺旋体苍白亚种，属于螺旋体体目、螺旋体科、密螺旋体属。

本属包括４种人的病原体和至少６种对人不致病的密螺旋体［4］。

其形态呈柔软纤细的螺旋状，体长６～２０μｍ，宽０．１５～０．２５μｍ，螺旋有８～２０个，运动特征为弯曲移动、绕轴转动和前后伸缩运动［5］。

其外膜厚４６ｎｍ，具有抗原性，抗外膜抗体在补体参与的条件下能杀灭梅毒螺旋体或使梅毒螺旋体制动。

梅毒螺旋体抗原还包括特异性耐热的多糖抗原（多糖－ＲＮＡ复合物）、特异性不耐热蛋白质、非特异性心磷脂抗原和类脂抗原。

梅毒的诊断要依据患者有无疾病接触史、实验室结果、症状和体征等综合判断。

二、梅毒流行病学据世界卫生组织估测，全世界每年新发梅毒感染者大约有1200万。

近年来，在淋病等性病的发病率有所下降的情况下，各期各类梅毒在许多发达和发展中国家出现不断上升的趋势，甚至在部分人群中发生暴发现象，其中特别是男性同性性行为者。

大部分发生在那些缺少有效检测手段的国家和地区。

在发展中国家，孕妇感染梅毒是造成不良妊娠的主要原因，其中大约30%为死胎，30%左右为先天性梅毒[3]。

近年来许多国家，特别是发展中国家，先天梅毒的报告发病率不断上升，是不容忽视的公共卫生问题。

近年来，世界各地梅毒发病率呈上升趋势，我国梅毒发患者数也快速增长，据报道，２０１０年全国报告梅毒病例３５８５３４例，２０１０年发病率２６．８６／１０万，比２００９年增加１７．０２％，居全国乙类传染病的第３位。

本病危害大，可侵犯皮肤黏膜、心血管、神经、骨骼等造成多系统损害，也可使妊娠期妇女发生流产、死胎和分娩先天梅毒儿。

在性传播疾病中，梅毒致死性仅次于艾滋病，其与艾滋病的传播途径相似，同时，梅毒作为一种溃疡性性病，可大大增加感染ＨＩＶ的风险，有报道称生殖器溃疡患者较健康人感染ＨＩＶ的危险性增加４～５倍［１］，因此，梅毒的流行在客观上促进了ＨＩＶ的传播，控制梅毒等相关的生殖器溃疡疾病，能有效控制ＨＩＶ的传播和艾滋病的发生。

目前，国内外学者也越来越重视梅毒螺旋体的研究。

二，梅毒的检测方法梅毒的实验室检查包括病原学检查、用聚合酶链反应ＰＣＲ检测梅毒螺旋体核酸和血清学试验，其中血清学试验包括密螺旋体抗体试验（特异性抗体）和非密螺旋体抗体试验（非特异性抗体），目前，临床上常用的检测梅毒的方法主要有：非特异性抗体：快速血浆反应素试验（RPR）、甲苯胺红快速反应素试验(TRUST)。

特异性抗体：梅毒螺旋体ELISA试验、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)等，还有免疫印迹法和PCR方法。

早期梅毒的诊断和及时治疗对于控制其蔓延至关重要，因此在临床工作中选择简单、快速、敏感性高和特异性强的检测方法将十分有助于梅毒的诊断[7]。

病原学检查直接荧光抗体试验ＤＦＡ该法目前国外应用较多，其特异性及敏感性均优于暗视野检查法。

从皮肤病灶或肿大淋巴结取样，涂片，在空气中干燥，用丙酮固定然后用异硫氰酸荧光素ＦＩＴＣ标记的特异性抗梅毒螺旋体单克隆抗体染色，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜激发光波长４８０ｎｍ下，可观察梅毒螺旋体发特异性黄绿色荧光。

暗视野显微镜检查暗视野显微镜检查是目前国内主要的梅毒病原学诊断方法，适用于一期梅毒及二期梅毒早期的检测。

一期梅毒苍白螺旋体多存在于硬下疳硬结，溃疡的分泌物、渗出液和肿大的淋巴结，二期梅毒可在全身血液和组织中检出梅毒苍白螺旋体，但以皮肤检出率最高。

从新鲜皮损处用盖玻片蘸取小量组织液，也可用无菌小环在病灶处刮取加入载玻片上的生理盐水上并混匀。

用注射器往淋巴结注入０．５ｍｌ无菌生理盐水，抽取液涂片。

通过羊膜穿刺获得羊水做暗视野显微镜观察，对先天性梅毒有诊断价值。

暗视野显微镜暗背景下观察，梅毒螺旋体呈白色发光，一般运动快速，也有较缓慢地围绕长轴旋转，可根据其典型的形态、大小和运动方式予以判断。

暗视野显微镜检查结果阴性，并不能排除感染，可能是由于取材不当、病灶处螺旋体数量太少，或者患者已接受抗生素治疗，皮肤病损趋向好转。

镜下观察到梅毒螺旋体即可作出诊断，但一般单次检查阳性率<５０％。

故应从多处病灶取样连续数次检查。

该方法要求所用物镜的数值孔径宜在1.00-1.25左右，载玻片和盖玻片必须无划痕且无灰尘，物镜前透镜也必须清洁无尘镜检时室内环境要暗。

镀银染色法与暗视野检查法的临床意义基本相同，取材方式也基本相同。

标本在空气中自然干燥后，用固定液将图片固定２-３min。

以无水酒精洗涤，然后加媒染剂２-３滴，加热使之产生蒸汽，染30min 后水洗,干燥后镜检。

该法利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察。

梅毒螺旋体核酸测定ＰＣＲ试验基本原理是酶促ＤＮＡ合成反应，即在模板ＤＮＡ引物和脱氧核糖核酸存在下在ＤＮＡ聚合酶的作用下，使ＤＮＡ链扩增延伸ＴＰ的ＰＣＲ扩增系统可分为扩增TPP47基因、扩增bmp基因扩增TPF-1蛋白基因和扩增TmpA基因等。

可分为PCR和RT-PCR。

ＰＣＲ的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和TpN47的ＤＮＡ开放编码区，RT-PCR常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA366bp片段。

检测标本为血、羊水、脑脊液、尿、皮损材料分泌物组织等。

对T.pallidum的特异性较高,但敏感性差异很大也无法区分T.pallidum亚种。

MGB-TaqMan探针的荧光定量PCR 法选择保守序列TPU57757作探针和引物，报告一期梅毒患者血清测定阳性率为80.4%，分泌物的阳性率为84.3%，其特异性为100％。

该方法能升高探针的Ｔｍ值，其背景荧光相对单纯的TaqMan探针更低，信噪比更好。

PCR测定法在一期梅毒的检测中灵敏性高于血清学方法,但PCR法容易受标本中的组织和细胞碎片等物质抑制而导致假阴性，故PCR检测不宜用作判愈。

1.梅毒螺旋体血清学试验梅毒血清学诊断试验方法很多，包括非特异性梅毒螺旋体抗体试验方法和特异性梅毒螺旋体抗体试验方法。

2.1梅毒螺旋体非特异性抗体血清学试验梅毒螺旋体非特异性抗体血清学试验测定的是血清中的抗心憐脂抗体，即反应素，从牛心肌中提取心磷脂，胆固醇以及纯化的磷脂酰胆碱组成类脂质抗原，作为该类试验的反应抗原。

反应素是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放的物质，而不是梅毒螺旋体所产生的直接抗体，因此该反应素属于抗心磷脂抗体，除了梅毒患者，它还存在于其他部分自身免疫性疾病和其他慢性疾病的非梅毒患者体内，因此阳性结果也不能完全确诊患者一定感染了梅毒螺旋体，只能是有感染的可能，因此这类实验叫做非特异性抗体检测试验。

由于患者反应素浓度在治疗后会降低或转阴，可用于观察评价治疗效果，有没有复发或者再次感染，因此，在大多数医院中，这类试验被用于梅毒的常规筛查和疗效评价。

对于二期梅毒的诊断评价较适合，而不适用于一期、三期梅毒的诊断，包括其他梅毒如潜伏期梅毒和神经梅毒。

除了在一些慢性疾病中该实验呈假阳性，如急、慢性感染，结缔组织病，溶血性贫血，妊娠，风湿或类风湿，吸毒，乙肝，结核和其它自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮等，在一些健康人和老年人中，也有假阳性情况出现，文献报道这类试验在没有梅毒螺旋体感染的正常人群中阳性率达0.1%[8]。

此外，这类试验还可出现假阴性，许多人为因素会对试验结果造成干扰，例如标本溶血、血清不新鲜以及污染等情况时。

2.1.2性病研究实验室试验（VDRL）美国科学家Pangborn等发表了一种性病研究实验室抗原(VDRL)，该抗原属于一种心磷脂抗原，主要成分是将适量的卵磷脂加入到从牛心肌中提取的心磷脂中，再加入适量的胆固醇，这样即增加了试验的抗原性又增强其抗体的敏感性。

该方法的优点是试验过程操作简单快速，试验结果可定量也可定性，试剂和对照血清均己被标准化生产，运行成本相对较低；缺点是结果的读取需要用显微镜来完成。

故国内实验室很少采用，但ＶＤＲＬ是唯一可用于神经性梅毒诊断的血清学方法。

2.1.3不加热血清反应素试验（USR）该试验是VDRL改良后的方法，病人标本血清可直接使用不需要灭活，将血清放置玻片上与抗原悬液反应，阳性者可形成肉眼可见的絮状物。

该试验方法的优点是操作简单，反应时间短，快速，血清不需要灭活处理，抗原悬液可长期保存，直接使用。

2.1.4快速血浆反应素试验（RPR）该实验的原理是将制备好的牛心磷脂抗原与标准的活性碳相结合，当这种抗原遇到梅毒患者血清中的心憐脂抗体就会结合形成复合物，出现凝集反应，即出现肉眼可见的凝集颗粒。

优点是操作简单，耗时短、不需要显微镜观察，试剂盒已商品化，抗原可直接使用，待测血清也不需要加热灭活，与抗原悬液直接混合，染色后的牛心磷脂抗原与血清中的抗体结合出现凝集反应，形成肉眼可见的黑色凝集颗粒，抗体含量越多，凝集颗粒越多，因此其滴度的变化可以反映治疗效果和病程变化，所以该实验在临床上常被用于观察梅毒治疗效果和随访有无复发或再感染，二期梅毒时体内抗体水平达到最高，血清学检查可阳性。

缺点是易出现假阳性，除梅毒螺旋体外，其他密螺旋体属的螺旋体也具有相同的类脂质抗原，抗原成分也相似，主要是心磷脂抗原，机体针对这类抗原所产生的抗体也可与牛心磷脂抗原发生阳性反应，即假阳性。

所检测的抗心磷脂抗体定量与梅毒的活动性有一定相关性，在疾病潜伏期和治疗后容易消失，对早期梅毒和治疗后梅毒的检出率低，对潜伏期和神经梅毒不敏感[10]。

而且对于SLE、抗磷脂抗体综合征等的自身免疫性疾病的患者，该试验易产生生物学假阳性。

在二期梅毒该抗体含量较高，还以产生前带效应，出现假阴性。

2.1.5甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)TRUST试验所用的抗原是从牛心肌提取的心磷脂和从鸡蛋黄提取的卵磷脂及胆固醇,与RPR法相比,TRUST试验是在试剂中加入了甲苯胺红溶液,阳性结果呈红色的不同程度的凝集块悬浮于液体中,在白色纸卡上,结果清晰易读,操作简便、快速、稳定性好。

对非特异性反应素导致的阳性标本,TRUST法的检出率和重复性都强于RPR 法,TRUST法比RPR法、USR法效价测定高出一个滴度。

但许多因素可影响结果,如高脂血症、抗心磷脂抗体阳性的血清均可导致假阳性结果。