分光光度法

分光度光度法

分光光度法学习资料

一、分光光度法的基本概念

1. 定义

- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。

2. 原理基础

- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。

- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。

- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。

- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。 二、分光光度计的结构与组成

1. 光源

- 提供足够强度和稳定的连续光谱。在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。

2. 单色器

- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。

3. 样品池

- 用于盛放被测溶液。在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。

4. 检测器

- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。常见的检测器有光电管和光电倍增管等。光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。

吸光光度法

一、选择题

1、用邻菲罗啉分光光度法测定纯金属锰中微量铁。若试剂和显色剂均无吸收，参比溶液应选:

A.蒸馏水； B.试剂空白；

C.含显色剂的试样溶液； D.不含显色剂的试样溶液

2、微量镍比色测定的标准曲线如下图所示。将1.0g钢样溶解成100mL试液，取此液再稀释10倍。在同样条件下显色后测得吸光度为0.30,则钢样中镍含量为:

A.0.05%; B.0.1%; C.0.5%; D.1%

3、下列不属于显色反应条件的是:

A.显色时间；B.入射光波长； C.显色的温度; D.干扰离子的排除

4、分光光度计的光路顺序，正确的是:

设1光源；2比色皿； 3单色器；4检测器； 5微安表

A.12345； B.13245

C.13254; D.12354

5、选择显色反应时，下列各因素可不必考虑的是:

A.反应产物的值的大小，愈大愈好；

B.反应应当具有较高的选择性或特效性；

C.显色剂对入射光波不应当有吸收或吸收极微；

D.控制反应进行时的酸碱度

6、某显色剂在pH为1~6时呈黄色，pH为6~12时呈橙色，pH大于13时呈红色。该显色剂与某金属离子配位后呈现红色，则该显色反应应在:

A.弱酸性溶液中进行； B.弱碱性溶液中进行；

C.弱碱性溶液中进行； D.中性溶液中进行

7、与示差分光光度法测得的吸光度成正比的是:

A.待测液的浓度； B.参比溶液的浓度；

C.待测液浓度与参比溶液的浓度和； D.待测液浓度与参比溶液的浓度差

8、在比色分光测定时，下述操作中正确的的是:

A.比色皿外壁有水珠； B.手捏比色皿的毛面；

C.手捏比色皿的磨光面； D.用普通白报纸去擦比色皿外壁的水

9、光度测定中使用复合光时，曲线发生偏离，其原因是:

分光光度法 科普

分光光度法（Spectrophotometry），简称分光法，是一种广泛应用于生物、化学、医药等领域的分析技术。它基于物质对不同波长光的吸收或透射性能，通过测量光的强度变化来定量或定性分析物质的浓度。本文将介绍分光光度法的原理、仪器配置以及应用。

一、原理

分光光度法的原理基于比尔－朗伯定律（Beer-Lambert Law），该定律描述了物质溶液对单色光的吸光度（Absorbance）与物质的浓度以及溶液的光程（即光线通过溶液的路径长度）成正比的关系。其数学表达式为：A = ε×c×l，其中A表示吸光度，ε是摩尔吸光系数，c是物质的浓度，l是光程。

当物质吸收一束光时，其吸收强度与入射光强度呈指数关系。通过对不同波长的光通过物质溶液后，测量出透射光的强度变化，可以推算出物质的浓度。

二、仪器配置

分光光度法常用的仪器是分光光度计，主要由光源、单色器、样品池、检测器和信号处理器组成。

1. 光源：分光光度计使用的光源通常是白炽灯或者氘灯。白炽灯可以发出连续谱的光，而氘灯通常用于紫外光区域的分析，因为氘灯可以发出紫外光谱。 2. 单色器：用于将连续谱的光分解为单色光，常见的单色器有棱镜和光栅。棱镜通过光的折射来将光分解为不同波长，而光栅则是通过光的衍射来实现。

3. 样品池：用于盛放溶液样品，通常是石英或玻璃制成。不同颜色的玻璃样品池会对特定波长的光产生吸收，因此石英或透明玻璃是更好的选择。

4. 检测器：分光光度计常用的检测器是光电二极管或光电倍增管。光电二极管可以将光转化为电信号，并输出给信号处理器。

5. 信号处理器：用于接收检测器发出的电信号，将其转化为可读的吸光度值，并进行数据处理。

三、应用

分光光度法在许多领域都有着广泛的应用。

1. 生物学领域：在生物学研究中，分光光度法可以用于分析DNA、蛋白质、酶活性等。例如，通过测量DNA溶液对260nm波长的紫外光的吸光度，可以估算出DNA的浓度和纯度。

分析化学实验教学指导

分光光度法实验

邻二氮菲分光光度法测定铁(条件实验)

光度法测定试样中铁含量

一、要求目的

1．掌握分光光度计和吸量管的使用方法。

2．学习如何选择分光光度分析的实验条件。

3．掌握分光光度法测定铁的原理及方法。

4．通过本次实验，应掌握初步设计分光光度分析方法的步骤。

二、实验原理

在pH为2－9的溶液中，Fe2+与邻二氮菲（phen）生成稳定的橘红色络合物Fe(Phen)32+:

其lgβ3=21.3,摩尔吸光系数ε508＝1.1×104L.mol-1cm-1。当铁为＋3价时，可用盐酸羟还原：2Fe3＋＋2NH2OH•HCl＝2Fe2＋＋N2↑＋4H＋＋2H2O＋2Cl-

Cu2+,Co2+,Ni2+,Cd2+,Hg2+,Mn2+,Zn2+等离子也能与Phen生成稳定络合物，在少量情况下，不影响Fe2＋的测定，量大时可用EDTA掩蔽或预先分离。

吸光光度法的实验条件，如测量波长，溶液酸度，显色剂用量、显色时间、温度、溶剂以及共存离子干扰及其消除等，都是通过实验来确定的。本实验在测定试样中铁含量之前，先做部分条件试验，以便初学者掌握确定实验条件的方法。

条件试验的简单方法是：变动某实验条件，固定其余条件，测得一系列吸光度值，绘制吸光度－某实验条件的曲线，根据曲线确定某实验条件的适宜值或适宜范围。

三、注意事项

1. 使用721B或722型分光光度计，提前布置学生预习P147~154，在每台仪器前附上一张“使用方法”，要求学生看后才操作。另外，还要预习P128~131中吸量管的使用方法。

2. 一般两位学生共用一台仪器，合作做实验，但实验报告各自写，提前通知学生自备坐标纸。两个实验作完后一起交报告。暂不统一评分标准，由各组自行综合考虑，原则上条件试验应与预期基本相符，相对误差5%以内为合格。

3. 用高级卫生纸作代用品擦干比色皿。要求学生实验完毕洗净比色皿，并将比色皿浸泡在盛有15%的3HNO溶液的烧杯中。