溴酚蓝与聚乙烯吡咯烷酮作用研究

.核酸电泳的双指示剂（溴酚兰和二甲苯青）与染色剂指示剂核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青。

溴酚兰在碱性液体中，呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb 的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。

指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。

载样缓冲液的作用有：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；③使样品呈色，使加样操作更方便。

琼脂糖电泳时往往在样品中同时加入这两种指示剂，溴酚蓝指示小片段DNA，二甲苯青指示大片段DNA。

PS：二甲苯青FF C25H27N2O6S2Na FW: 538.6 用于琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶电泳的示踪染料, 易溶于水和醇，带电荷数少，移动速度慢。

染色剂核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。

溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。

注意：EB具有强致癌性，因此需要防止污染，避免皮肤接触，操作时要控制在划定的污染区，戴一次性塑料手套，废弃物妥善处理。

银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。

实验室常用缓冲液配置方案1)1 M Tris-HCI (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCI配制量：1 L配制方法：1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。

4•将溶液定容至1 L。

5.咼温咼压火菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大, 温度每升高1C,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2)10 开E Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA 配制量：1 L配制方法：1.量取下列溶液，置于1 L烧杯中。

3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

3) 1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。

4. 将溶液定容至1 L。

5. 咼温咼压火菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大, 温度每升高1C,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

4) 3 M 醋酸钠(pH5.2)组份浓度：3M醋酸钠配制量：100ml配制方法：1•称量40.8g NaAc 3H2O (或者24.6g无水NaAc)置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解2•加入冰醋酸调节pH值至5.23•加去离子水将溶液定容至100ml4咼温咼压火菌后，室温保存。

5)PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 配制量：1 L配制方法：2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

目录1 茎尖脱毒技术操作规程 (1)1.1 设备条件 (1)1.1.1 试剂配置室 (1)1.1.2 洗涤及灭菌室 (2)1.1.3 无菌室 (2)1.1.4 培养室 (2)1.2 材料的选择 (2)1.3 类病毒和病毒的检测 (2)1.3. 1 类病毒的检测 (2)1.3.2 病毒检测 (9)1.3.3 脱毒材料热处理 (13)1.4 培养基的制备 (13)1.4.1 培养基母液配制 (13)1.4.2 培养基配制 (15)1.5 外植体灭菌 (17)1.6 茎尖剥离前消毒 (17)1.7 茎尖剥离与接种 (17)1.8 培养 (17)1.9病毒检测筛选脱毒苗 (17)1.10 品种典型性鉴定 (18)2 脱毒苗快繁技术操作规程 (18)2.1 茎切段培养基繁殖 (19)2.1.1 扩繁前的准备工作 (19)2.1.2 茎切段和接种 (19)2.1.3 培养 (19)2.2 扦插苗扩繁 (21)2.2.1 培养基础苗 (21)2.2.2 基础苗移栽 (21)2.2.3 基础苗剪切 (21)2.2.4 基础苗切段后的管理 (22)2.2.5 扦插苗 (22)2.2.6 扦插苗管理 (23)马铃薯茎尖脱毒及脱毒苗快繁技术操作规程1 马铃薯茎尖脱毒技术操作规程马铃薯健康种薯的生产方法主要有利用茎尖脱毒快繁技术生产无病毒种薯、田间系选生产良种和实生种子生产无毒实生薯等，其中植物茎尖分生组织培养脱毒技术（即茎尖脱毒）在实际的农业生产中应用最为广泛并取得了巨大成功。

茎尖脱毒技术是根据病毒在植物体内分布不均和茎尖分生组织带毒少的原理，结合使用钝化病毒的热处理方法，通过剥离茎尖分生组织进行培养获得脱毒植株。

这一技术具有周期短、效率高、能与组织培养快速繁殖相结合等特点。

目前除一些类病毒外，绝大多数植株病毒都可以通过茎尖脱毒技术进行脱除。

经茎尖分生组织培养获得的植株经病毒检测并确认其不带病毒后可进一步利用，对仍带有病毒的株系进行淘汰或再脱毒。

实验室常用洗液配制方法实验室洗液的配制方法一：铬酸洗液:配制浓度各有不同，从5~12%的各种浓度都有。

配制方法大致相同：取一定量的K2Cr2O7（工业品即可），先用约1~2倍的水加热溶解，稍冷后，将工业品浓H2SO4所需体积数徐徐加入K2Cr2O7不溶液中（千万不能将水或溶液加入H2SO4中），边倒边用玻璃棒搅拌，并注意不要溅出，混合均匀，俟冷却后，装入洗液瓶备用。

新配制的洗液为红褐色，氧化能力很强。

当洗液用久后变为黑绿色，即说明洗液无氧化洗涤力。

例如, 配制12%的洗液500mL 。

取60克工业品K2Cr2O7置于100mL 水中（加水量不是固定不变的，以能溶解为度），加热溶解，冷却，徐徐加入浓硫酸：３４０mL ，边加边搅拌，冷后装瓶备用。

二：碱性高锰酸钾洗液用碱性高锰酸钾作洗液，作用缓慢，适合用于洗涤有油污的器皿。

配法：取高锰酸钾（KMnO44克加少量水溶解后，再加入１０％氢氧化钠（NaOH １００mL 。

三：纯酸纯碱洗液根据器皿污垢的性质，直接用浓硫酸（HCL ）或浓硫酸（H2SO4 、浓硝酸HNO3浸泡或浸煮器皿（温度不宜太高，否者浓酸挥发刺激人）。

纯碱洗液多采用１０％以上的浓烧碱（NaOH 、氢氧化钾（KOH 或碳酸钠（Na2CO3 液浸泡或浸煮器皿（可以煮沸）。

四：碱性乙醇洗液溶解120克氢氧化钠固体于120ml 水中，用95%乙醇稀释至1L 。

在铬酸洗液洗涤无效时，用于清洗各种油污；由于碱对玻璃的腐蚀，玻璃磨口不能长期在该洗液中浸泡；须存放于胶塞瓶中，防止挥发、防火，久注易失效五：碱性高锰酸钾洗液 4克高锰酸钾固体溶于少量水中，再加入100ml10%氢氧化钠溶液清洗玻璃器皿内的有无或其他有机物质；浸泡后器壁上会析出一层二氧化锰，需用盐酸或盐酸加过氧化氢除去六：磷酸钠洗液 57克磷酸钠、28克油酸钠溶于470ml 水中清洗玻璃器皿上的残留物；浸泡数分钟后用刷子刷洗七：酸性硫酸亚铁洗液含有少量硫酸亚铁溶液清洗由于贮存高锰酸及洗液而残留在玻璃器皿上的棕色污斑；浸泡后洗刷八：硝酸－过氧化氢洗液 15%－20％的硝酸加等体积的5%过氧化氢清除特殊难洗的化学污物久存易分解，应存放于棕色瓶九：有机溶剂如三氯乙烯、二氯乙烯、苯、二甲苯、丙酮、乙醇、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、汽油等清除玻璃器皿上的油脂类、单体原液、聚合体等有机污物，应根据污物性质选者使用注意毒性、可燃性，用过的废液溶剂应回收十：硫代硫酸钠洗液 10%的硫代硫酸钠溶液。

发酵香草兰豆荚主要风味成分及其前体物与蛋白的变化蔡莹莹;陈星星;谷风林;徐飞【摘要】探究了香草兰发酵过程中主要风味物质及其前体物的消长规律以及蛋白的动态变化.香草兰豆荚的发酵过程分为杀青、发汗、干燥和陈化4个阶段,期间豆荚发生复杂的变化并产生香味.通过LC-MS/MS方法对风味前体物和主要风味物质分析的结果表明:风味前体物L-苯丙氨酸的含量在发汗阶段达到顶峰,进一步发酵时含量降低;L-酪氨酸的含量在发汗、干燥、陈化阶段逐渐降低;阿魏酸和葡萄糖的含量从鲜豆荚到杀青豆荚逐渐升高,发汗阶段下降,干燥和陈化阶段又逐渐升高;咖啡酸和肉桂酸的含量在干燥阶段下降,陈化阶段开始回升;对香豆酸和松柏醇从鲜豆荚到干燥阶段的含量逐渐降低,陈化阶段开始回升;主要风味物质香草酸和香兰素从杀青阶段到陈化阶段的含量逐渐增加;对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛都是在发汗阶段含量最低,在干燥和陈化阶段逐渐升高;电泳图表明鲜豆荚和杀青豆荚的蛋白分布范围比较宽,陈化豆荚的蛋白分布范围比较集中,并且随着发酵的进行蛋白条带逐渐减少.本研究为完善发酵生香技术,提高豆荚质量提供理论依据.【期刊名称】《热带农业科学》【年(卷),期】2019(039)003【总页数】11页(P80-90)【关键词】香草兰;风味前体物;风味成分;蛋白【作者】蔡莹莹;陈星星;谷风林;徐飞【作者单位】华中农业大学食品科学技术学院湖北武汉430070;中国热带农业科学院香料饮料研究所海南万宁571533;华中农业大学食品科学技术学院湖北武汉430070;中国热带农业科学院香料饮料研究所海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所海南万宁571533;国家重要热带作物工程技术研究中心海南万宁571533;海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所海南万宁571533;国家重要热带作物工程技术研究中心海南万宁571533;海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心海南万宁571533【正文语种】中文【中图分类】TQ651+2香草兰(Vanilla planifolia Andrews)又名香荚兰，原产于墨西哥，典型的热带兰科作物，被誉为“食品香料之王”[1]。

尿液干化学分析原理及其临床意义尿液的干化学分析在各级医院甚至诊所的应用已经十分普遍，各品牌的尿分析仪及其配套试纸虽略有差异，项目代码也略有不同，但检测原理基本相同：一、葡萄糖（GLU)[反应原理]：采用酶法测试，用两种酶，分别是葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。

主要反应过程如下：现在几乎所有的试纸都是采用酶法，因为酶法具有特异性强、灵敏度高、反应时间短等优点。

不同型号的试纸所选用的指示剂有所不同。

[临床意义]：1. 生理性糖尿为一过性糖尿，是暂时性的，排除生理因素后恢复正常。

主要有三种：①饮食性糖尿，即在短时间内服用大量糖类，引起血糖浓度过大；②应急性糖尿，在脑外伤、脑血管意外、情绪激动、剧烈运动周期性四肢麻痹等情况下，延脑糖中枢受刺激，使肾上腺激素或胰岛素分泌异常，可出现暂时性的糖尿；③妊娠中后期多可见糖尿。

2. 病理性糖尿也可分为三种：①真性糖尿，既胰岛素的分泌量相对或绝对不足，使血糖浓度超过肾糖阈尿糖检查不仅可以诊断糖尿病，还可以指导临床医生决定胰岛素的用量、判断疗效；②肾性糖尿，即肾小管对葡萄糖的重吸收功能减退，新生儿的近曲小管功能未完善也能出现糖尿；③其他糖尿，如生长激素过多（肢端肥大症）、甲状腺激素过多（甲亢）、肾上腺激素过多（嗜铬细胞瘤）、皮质醇（Cμshing综合症）、胰高血糖素等都可使血糖浓度高过肾糖阈而出现糖尿；另外，肥胖病、高血压也可能出现糖尿。

[注意事项]：1. 因为尿糖分析试纸的后一步反应是氧化还原反应，当尿液中含有比色素还原能力更强的物质时，可使测试结果偏低甚至出现假阴性。

如尿液中含有维生素C时就能使测试结果偏低甚至假阴性。

2. 抗生素对班氏法糖定性、糖定量测定结果都有一定的影响，而对干化学法的测试结果无影响。

尿液存放时间过长也能使尿糖被细菌分解使浓度下降，但含有抗生素时几乎不下降。

3. 高浓度的酮体尿可引起假阴性；尿液比重增高，可降低试剂带对尿糖的敏感性；服用大量左旋多巴时，该药物的代谢产物会对测试反应产生抑制作用，使测试结果偏低或出现假阴性；尿液被过氧化物或次氯酸盐等强氧化性物质污染的时候能出现假阳性。

实验室常用缓冲液配置方案1)1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

值。

4.将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。

2)10×TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA配制量：1 L配制方法：2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。

3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

3)1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调节pH值至。

4. 将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。

4)3 M 醋酸钠(pH5.2)组份浓度：3M 醋酸钠配制量：100ml配制方法：1.称量40.8g NaAc·3H2O〔或者NaAc〕置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解2.加入冰醋酸调节pH值至5.23.加去离子水将溶液定容至100ml4高温高压灭菌后，室温保存。

5)PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L配制方法：2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

常见实验用溶液的配制方法[日期：2005-1-9] 来源：作者：[字体：大中小]一.常用贮液与溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。

10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。

不要涡旋混合。

加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。

或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。

8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。

1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。

3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。

或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。

1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。

实验室常用溶液的配制1mol/L亚精胺（Spermidine）:溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammoniumacetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。

或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。

8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。

1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。

3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

1mol/LHCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。

1mol/LMgCl2:溶解20.3gMgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。

5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。

10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。

10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。

溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。

用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。

（配制过程中要戴手套）。

2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。

实验室常用缓冲液配置方案1)1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

值。

4.将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2)10×TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA配制量：1 L配制方法：2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。

3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

3)1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。

4. 将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

4)3 M 醋酸钠(pH5.2)组份浓度：3M 醋酸钠配制量：100ml配制方法：1.称量40.8g NaAc·3H2O（或者24.6g无水NaAc）置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解2.加入冰醋酸调节pH值至5.23.加去离子水将溶液定容至100ml4高温高压灭菌后，室温保存。

5)PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L配制方法：2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

藜麦基因组 DNA 提取方法的比较陆敏佳;莫秀芳;王勤;陆国权;蒋玉蓉【摘要】为了快速获取高质量的藜麦基因组DNA，采用改良的CTAB法、SDS法和高盐低pH值法等3种方法分别提取藜麦不同组织（叶、茎、根部）的基因组DNA。

通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法测定比较所提DNA的质量和产量，同时进行了PCR-SSR、SSCP等分子检测。

用不同方法提取藜麦不同组织部位DNA的结果表明：不同提取方法的凝胶检测条带均比较清晰，且无明显降解；改良的CTAB法所提取的DNA产率最高，SDS法其次，而高盐低pH值法最低；不同方法提取的叶片DNA产率均明显高于根部和茎部；改良的CTAB法和高盐低pH值法所提取的DNA质量较好，多酚类化合物和多糖等杂质去除得比较完全。

PCR-SSR和SSCP检测结果表明：不同方法和不同组织所提取的DNA均能跑出良好的条带，适合进行后续的分子生物学研究。

【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】4页(P42-45)【关键词】藜麦;DNA提取方法;分子检测;SSR;SSCP【作者】陆敏佳;莫秀芳;王勤;陆国权;蒋玉蓉【作者单位】浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300;浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300;浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300;浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300;浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300【正文语种】中文【中图分类】S512.901藜麦(Chenopodium quinoa Willd)，又称南美藜、藜谷、奎奴亚藜等，是一年生的藜科草本作物，原产于南美洲安第斯山脉海拔2 800～4 200 m的地区，分布于12°N～39°S的范围，在安第斯山脉已有5 000多年的种植历史，被印加人称为“谷物之母”[1]。

藜麦蛋白质含量高，具有近乎完美的氨基酸组成，含有较高的钙磷铁，是联合国FAO唯一认定的完美营养食品，被誉为“未来的超级谷物”“营养黄金”“有机谷类之王”等[2-3]。

ICS67.060B 22 DB13 河北省地方标准DB13/T 2598—2017 花生品种真实性与纯度鉴定SSR法2017-11-22发布2017-12-22实施前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：杨鑫雷、刘立峰、崔顺立、郭丽果、陈焕英、穆国俊、李洪珍。

花生品种真实性与纯度鉴定SSR法1 范围本标准规定了利用SSR标记对花生品种真实性与纯度进行鉴定的术语和定义、原理、试剂材料、操作程序、数据分析和判定规则。

本标准适用于利用SSR法对花生品种真实性与纯度鉴定的试验过程。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 3543.2-1995 农作物种子检验规程扦样GB/T 3543.4-1995 农作物种子检验规程发芽试验GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1品种真实性（Varietal Genuineness）供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。

3.2品种纯度（Varietal Purity）品种在特征特性方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。

3.3简单重复序列 SSR（Simple Sequence Repeat）基因组中以几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列，又称微卫星标记。

注：由于基本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性。

3.4聚合酶链式反应 PCR（Polymerase Chain Reaction）一种用于在体外扩增 DNA 序列的技术程序。

注：模板 DNA 经高温变性为单链，在 DNA 聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与 DNA 模板两条链上的一段互补序列发生退火，并在 DNA 聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成 DNA。

实验室常用缓冲液配置方案1)1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

值。

4. 将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2)10×TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA配制量：1 L配制方法：2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。

3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。

4. 室温保存。

3)1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L配制方法：1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。

4. 将溶液定容至1 L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

4)3 M 醋酸钠(pH5.2)组份浓度：3M 醋酸钠配制量：100ml配制方法：1.称量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml烧杯中，加入月40ml的去离子水搅拌溶解2.加入冰醋酸调节pH值至5.23.加去离子水将溶液定容至100ml4高温高压灭菌后，室温保存。

5)PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L配制方法：2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。

（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。

Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。