酶工程复习资料二

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酶(enzyme):酶是具有生物催化功能的生物大分子,按照其化学组成,可分为蛋白类酶(P酶)和核酸类酶(R酶)

酶工程:酶的生产与应用的技术过程。

水活度:指体系中水的逸度与纯水逸度之比。a w=Y w X w

酶的固定化:采用各种方法,将酶与水不溶性的载体结合,制备固定化酶的过程。

固定化酶:固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。

氨基酸置换修饰:将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。

定点突变:在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。

侧链基团修饰:采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。

金属置换修饰:把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。

大分子结合修饰:采用水溶性大分子与本科的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的特性与功能的方法。酶的提取:在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程,也称为酶的抽提。

沉淀分离:通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。

酶分子修饰:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。

盐析沉淀法:简称盐析法,是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从而使酶与杂质分离的过程。

等电点沉淀法:利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性,通过调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。

有机溶剂沉淀法:利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的某些有机溶剂,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。

同步合成型:酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。

延续合成型:酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合成一段较长时间。

中期合成型:该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的生物合成也随之停止。

滞后合成型:在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累,又称为非生物偶联型。

细胞生长曲线:在微生物的分批培养过程中,定时取样测定单位体积里的细胞数,以单位体积中的细胞数的对数为纵坐标,以培养时间为横坐标,可得到的繁殖曲线。

1913年,米彻利斯和曼吞的米氏方程:

1926年,萨姆纳首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶,并证明它具有蛋白质的性质。

酶催化作用的特点:专一性强、效率高、条件温和。

影响酶催化作用的因素:底物浓度、酶浓度、温度、pH值、抑制剂、激活剂。

抑制剂可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。

竞争性抑制特点:酶催化反应的最大反应速度Vm不变,而米氏常数Km增大。

非竞争性抑制特点:最大反应速度Vm减小,而米氏常数Km不变。

反竞争性抑制特点:最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。

蛋白类酶(P酶)的分类:氧化还原酶;转移酶;水解酶;裂合酶;异构酶;合成酶(连接酶)。

酶活力测定方法:化学测定法、光学测定法、气体测定法等。

酶活力测定的两个阶段:1、在一定条件下,酶与底物反应一段时间;2、测定反应液中底物或产物的变化量。

酶活力测定的步骤:1、根据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配制成一定浓度的底物溶液。2、根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。3、在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间。4、反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底的减少量。

酶活力单位:在特定条件下,每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位(IU)或在特定条件下,每1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特(kat)。

固定化酶的活力测定:振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法、固定化酶的比活力测定、酶结合效率与酶活力回收率的测定、相对酶活力的测定。

酶的生产方法:提取分离法、生物合成法、化学合成法。

固定化细胞发酵的特点:①细胞密度大,可提高产酶能力;②发酵稳定性好,可以反复使用或连续使用较长的时间;③细胞固定在载体上,流失较少,可以在高稀释率的条件下连续发酵,利于连续化、自动化生产;④发酵液中含菌体较少,利于产品分离纯化。

固定化微生物原生质体发酵特点:1、固定化原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障,有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外。2、采用固定化原生质体发酵,使原来存在于细胞间质中的物质,如碱性磷酸酶,游离到细胞外,变为胞外产物。3、固定化原生质体由于有载体的保护作用,稳定性好,可以连续或重复使用较长的一段时间。

用于酶的生产的细胞必须具备的条件:①酶的产量高;容易培养和管理;②产酶稳定性好;③利于酶的分离纯化;④安全可靠,无毒性。

常用的产酶微生物:细菌(大肠杆菌、枯草杆菌)、放线菌(链霉菌)、霉菌(黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉)、酵母(啤酒酵母、假丝酵母)。

常用的保藏方法:斜面保藏法、沙土管保藏法、真人冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法等。

微生物发酵产酶的一般工艺流程:①细胞活化与扩大培养;②培养基的配制;③pH值的调节控制;④温度的调节控制;⑤溶解氧的调节控制。

提高酶产量的措施:①添加诱导物;②控制阻遏物的浓度;③添加表面活性剂;④添加产酶促进剂。

酶生物合成的模式及其特点:①同步合成型(该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成,但是不受分解代谢物的阻遏作用,也不受产物的反馈阻遏作用,其对应的mRNA很不稳定)、②延续合成型(该类型酶的生物合成可以受诱导物的诱导,一般不受分解代谢物阻遏,其对应的mRNA相当稳定,在平衡期以后的相当长的一段时间内仍然可以通过翻译合成其所对应的酶)、③中期合成型(酶的生物合成受到产物的包馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用,而酶所对应的mRNA稳定性较差)、④滞后合成型(酶所对应的mRNA稳定性很好)。

固定化细胞发酵产酶的特点:①提高产酶率;②可以反复使用或连续使用较长时间;③基因工程菌的质粒稳定,不易丢失;④发酵稳定性好;⑤缩短发酵周期,提高设备利用率;⑥产品容易分离纯化;⑦适用于胞外酶等胞外产物的生产。

固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制:①固定化细胞的预培养;②溶解氧的供给;③温度的控制;④培养基组分的控制。

固定化原生质体的特点:①变胞内产物为胞外产物;②提高酶产率;③稳定性较好;④易于分离纯化。

固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制:①渗透压的控制;②防止细胞壁再生;③保证原生质体的浓度。

植物细胞培养的特点:①提高产率;②缩短周期;③易于管理,减轻劳动强度;④提高产品质量等。

植物细胞培养的工艺流程:①外植体的选择与处理;②植物细胞的获取;③细胞悬浮培养;④分离纯化。