慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法

慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。

与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。

本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。

一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。

慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。

另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。

二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。

构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。

基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。

包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。

包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。

将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。

经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。

三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。

1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。

通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。

2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。

外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。

慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。

3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。

通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。

此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。

慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。

慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。

慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。

在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。

2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。

通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。

3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。

4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。

通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。

总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。

慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。

下面将分别对这些步骤进行详细介绍。

首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。

常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。

在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。

其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。

一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。

在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。

接下来是包装步骤。

包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。

常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。

在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。

最后是转染步骤。

转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。

在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。

总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。

通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。

慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。

因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。

为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。

慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。

慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。

不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。

以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。

准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。

慢病毒包装实验流程、原理与步骤慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

慢病毒包装实验流程如下：1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因；2.根据客户要求选择对应载体；3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体；4. 测序鉴定重组质粒，高纯化（不含内毒素）提取的重组质粒；5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞，进行病毒包装并收集上清液；6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；7. 使用病毒液感染 293T 细胞，药物筛选细胞，构建稳定表达细胞系。

慢病毒使用安全及注意事项1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。

如果使用超净台请不要打开风机。

2.慢病毒感染实验时，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。

3.操作病毒时尽量避免气雾或者飞溅。

如果溅出，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

4.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用Parafilm膜封口后离心。

5.废弃的含有病毒的培养基或者病毒接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液（1:20），浸泡一天后丢弃。

慢病毒包装实验方法慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。

在细胞实验中，对于按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过使用病毒介导的方式能够大大提高基因的转导效率，达到目的基因高效表达的目的。

具体来说，慢病毒包装主要应用于以下几个方面：1、对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，极大地方便了RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究；2、进行稳转细胞株的筛选；3、为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；为产生高滴度的病毒颗粒，通常需要利用慢病毒表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。

离心收集上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

慢病毒包装及检测工具：1.慢病毒包装工具细胞293Ta（LT008）；2.慢病毒包装试剂盒（LT001）；3.慢病毒浓缩试剂盒（LT007）慢病毒包装实验方法构建含有目的基因的慢病毒表达载体（GeneCopoeia可提供各种慢病毒载体的ORF、启动子、shRNA、miRNA前体和miRNA抑制剂克隆）细胞准备：细胞传代后，密度达到70％左右时进行转染；转染复合物制备：取两个EP管，一个（A管）加入慢病毒载体的表达质粒、混合包装质粒和Opti-MEMI；另一个（B管）加入Opti-MEMI、转染试剂，一边轻柔涡旋A管，一边往A管滴加B管的溶液。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。

慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。

下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。

2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。

3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。

4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。

5.限制性内切酶：用于DNA切割。

6.DNA连接酶：用于DNA连接。

7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

9.细胞培养基：用于细胞培养。

10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。

11.抗生素：用于防止细胞污染。

12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。

二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。

3.水浴锅：用于保温反应液。

4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5.细胞培养箱：用于细胞培养。

6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。

7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。

8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。

三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。

2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。

3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。

慢病毒包装的原理慢病毒（lentivirus）是一类能够将基因信息稳定地整合到宿主细胞基因组中的病毒，因其具有较高的转染效率和广泛的宿主细胞范围而被广泛应用于基因治疗、基因编辑和细胞治疗等领域。

慢病毒的包装是指将外源基因载体包装入慢病毒颗粒中，使其具有传递和整合到宿主细胞基因组的能力。

本文将介绍慢病毒包装的原理及其相关技术。

慢病毒包装的原理主要包括载体构建、包装细胞系和包装技术三个方面。

首先是载体构建，即将外源基因插入到慢病毒基因组中，构建成慢病毒表达载体。

慢病毒基因组包括基因组RNA和辅助质粒DNA两种形式，通过重组技术将外源基因插入到慢病毒基因组中，并在适当的位点上加入启动子、终止子和调控元件，构建成慢病毒表达载体。

其次是包装细胞系的建立。

包装细胞系是指能够表达慢病毒包装蛋白的细胞系，通常采用293T细胞或HEK293细胞。

通过转染慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白，从而实现慢病毒颗粒的包装和产生。

最后是包装技术，主要包括质粒转染、病毒包装和病毒收集等步骤。

质粒转染是指将慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒转染至包装细胞系，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白。

病毒包装是指慢病毒包装蛋白识别慢病毒基因组RNA，并将其包装成慢病毒颗粒的过程。

病毒收集是指通过超速离心或滤膜浓缩等方法，从包装细胞系的培养上清中收集慢病毒颗粒。

总的来说，慢病毒包装的原理是通过构建慢病毒表达载体，利用包装细胞系表达慢病毒包装蛋白，将外源基因包装入慢病毒颗粒中，最终实现慢病毒的包装和产生。

这一技术为基因治疗和基因编辑研究提供了重要工具，也为细胞治疗等领域的发展提供了有力支持。

随着基因治疗和细胞治疗的不断发展，慢病毒包装技术的进一步优化和改进将为相关研究和临床应用带来更多的机遇和挑战。

慢病毒载体包装构建过程原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。

对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒—1 (H IV—1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。

携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系.慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。

包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能.将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞），即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒.载体成分:与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

缓病毒载体包拆构修历程之阳早格格创做本理：缓病毒载体不妨将中源基果大概中源的shRNA灵验天调整到宿主染色体上，进而达到少期性表黑手段序列的效验.正在熏染本领圆里可灵验天熏染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、搞细胞等多种典型的细胞，进而达到良佳的的基果治疗效验.对付于一些较易转染的细胞，如本代细胞、搞细胞、没有瓦解的细胞等，使用缓病毒载体，能大大普及手段基果大概手段shRNA的转导效用，且手段基果大概手段shRNA调整到宿主细胞基果组的几率大大减少，不妨比较便当快速天真止手段基果大概手段shRNA的少暂、宁静表黑.观念：缓病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 根源的一种病毒载体，缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息，是缓病毒载体系统的主要组成部分.携戴有中源基果的缓病毒载体正在缓病毒包拆量粒、细胞系的辅帮下，通过病毒包拆成为有熏染力的病毒颗粒，通过熏染细胞大概活体构造，真止中源基果正在细胞大概活体构造中表黑.辅帮身分：缓病毒载体辅帮身分包罗：缓病毒包拆量粒战可爆收病毒颗粒的细胞系.缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息.缓病毒包拆量粒可提供所有的转录并包拆RNA 到沉组的假病毒载体所需要的所有辅帮蛋黑.为爆收下滴度的病毒颗粒，需要利用表黑载体战包拆量粒共时共转染细胞，正在细胞中举止病毒的包拆，包拆佳的假病毒颗粒分泌到细胞中的培植基中，离心博得上浑液后，不妨曲交用于宿主细胞的熏染，手段基果加进到宿主细胞之后，通过反转录，调整到基果组，进而下火仄的表黑效力分子.基根源基本理：缓病毒载体系统由二部分组成，即包拆身分战载体身分.包拆身分：由HIV-1基果组去除了包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列而构修，不妨反式提供爆收病毒颗粒所必须的蛋黑.包拆身分常常被合并构修到二个量粒上，一个量粒表黑Gag战Pol蛋黑，另一个量粒表黑Env蛋黑，其手段也是落矮回复成家死型病毒的大概.将包拆身分与载体身分的3个量粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可正在细胞上浑中支获惟有一次性熏染本领而无复造本领的、携戴手段基果的HIV-1载体颗粒.载体身分：与包拆身分互补，即含有包拆、顺转录战调整所需的HIV顺式效用序列，共时具备同源开用子统造下的多克隆位面及正在此位面拔出的手段基果.为落矮二种身分共源沉组回复成家死型病毒的大概，需尽管缩小二者的共源性，如将包拆身分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)坐时早期开用子、3′LTR换成SV40 polyA等.一、真验过程（1战2为并列步调）安排上下游特同性扩删引物，共时引进酶切位面，PCR(采与下保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA 量粒大概者文库）调与手段基果CDS区（coding sequence）连进T载体.将CDS区从T载体上切下，拆进缓病毒过表黑量粒载体.合成siRNA对付应的DNA颈环结构，退火后连进缓病毒搞扰量粒载体3. 缓病毒载体的包拆与浓缩杂化造备缓病毒脱梭量粒及其辅帮包拆本件载体量粒，三种量粒载体分别举止下杂度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 调换为真足培植基，培植24战48h后，分别支集富含缓病毒颗粒的细胞上浑液，病毒上浑液通过超离心浓缩病毒.二、真验资料2.1缓病毒载体、包拆细胞战菌株该病毒包拆系统为三量粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中量粒上的ZsGreen1表黑框能表黑绿色荧光蛋黑（GFP）.载体疑息1)缓病毒克隆载体图谱如下：2）包拆量粒疑息如下：PMD2G载体图谱战序列疑息PSPAX2载体图谱战序列疑息：细胞株293T，缓病毒的包拆细胞，为揭壁依好型成上皮样细胞，死少培植基为DMEM(含10% FBS).揭壁细胞经培植死少删殖产死单层细胞. 菌株大肠杆菌菌株DH5α.用于扩删缓病毒载体战辅帮包拆载体量粒.三、过程图。

病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。

以慢病毒为例。

慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

L■町析*riVMvsIk]?对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。

本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。

一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。

慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。

这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。

二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。

2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。

三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。

2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。

3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。

4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。

5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。

6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。

四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。

2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。

3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。

4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。

5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。

6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。

如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4) 无需任何转染试剂，操作简便。

5) 可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。

3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4) 病毒的纯化和浓缩。

5) 分装、-80 C 保存。

6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

1、慢病毒的简介：Lentivirus是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特性；能整合入宿主细胞基因组，长期表达，可用于转基因动物制备；但也有不同于逆转录病毒的组分和特性；比逆转录病毒具有更高的滴度，不仅可以感染分裂细胞，更重要的是还能感染非分裂的细胞。

利用Lentivirus构建的shRNA表达载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以替代后者，另一方面，Lentivirus-shRNA载体经包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞（如原代细胞、悬浮细胞等），并且在感染后可以整合到受感细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，是制备稳定表达shRNA细胞株和进行体内实验(in vivo)的最有效手段。

2、慢病毒载体构建包装实验流程如下：1. 根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等），构建含有外源基因或序列的重组载体；2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量（不含内毒素）的重组质粒；3. 使用高效重组载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装并收集上清液；4. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；5. 用病毒液感染293T细胞，测定病毒滴度；用高质量的病毒液感染靶细胞，通过定量PCR或者Westenblot检测目的基因表达，也可以进一步进行稳定细胞株的筛选用于长期的功能学研究。

3、RNAi与慢病毒载体技术近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。

这种转录后基因沉默机制(PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。

通过构建RNAi 表达载体制备shRNA(发卡结构小干扰RNA)，已成为进行RNA干扰实验的常用手段之一。

而目前为了感染原代细胞和难感染的细胞系或者在动物水平进行RNAi，研究科学家更多的选择了慢病毒载体。

在RNAi的研究中，为了感染原代细胞和难感染的细胞系，科学家开始借助于病毒载体实现RNAi；由于慢病毒可以同时感染分裂和非分裂细胞、整合性以及免疫原性低等优点，目前在RNAi的研究中，基于慢病毒构建的shRNA被最广泛的使用。

慢病毒包装试验慢病毒包装试验慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础进展起来的基因治疗载体。

慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。

现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 讨论以及活体动物试验中。

一、试验流程图 1、慢病毒包装试验流程图二、试验仪器与试验材料psPAX2 质粒，pMD2.G 质粒，pHBLVTM系列质粒；293T 细胞；wan全培育基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、试验步骤1. 质粒扩增。

将构建好的慢病毒载体和包装质粒使用大抽试剂盒进行质粒的去内毒素抽提，浓度建议不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.71.8 间方可用于病毒包装。

推举使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

2. 脂质体转染。

转染前一天，在10 cm皿中接种生长状态良好的293T细胞，以第二天汇合度能达到 30% ～ 50% 为宜。

24 h 后转染，转染前需要把 DMEM 和慢病毒包装专用转染试剂 LentiFitTM恢复至室温，使用前需摇匀。

每个皿的质粒成分如下：表 1、慢病毒包装转染体系用于包装的三个质粒摩尔比通常为 1:1:1，可以依据情况稍加调整。

请参考 LentiFitTM转染试剂说明书进行转染操作，转染后46 h 换新鲜培育基。

3. 病毒收集和离心。

转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液），将收集的上清用0.45 μm滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

4. 病毒重悬和保存。

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于80 ℃ 或液氮罐保存。