一个典型的DNA重组包括五个步骤：
（1）目的基因的获取 目前，获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工合成法。 反向转录法,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA（cDNA），然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获取所需的基因的方法。从细胞基因组中直接分离目的基因常用"鸟枪法"，因为这种方法犹如用散弹打鸟,所以又称"散弹枪法"。用"鸟枪法"分离目的基因，具有简单、方便和经济等优点。化学合成目的基因是20世纪70年代以来发展起来的一项新技术。应用化学合成法，可在短时间内合成目的基因。目前已相继合成了人的生长激素释放抑制素、胰岛素、干扰素等蛋白质的编码基因。
（2）DNA分子的体外重组 体外重组是把载体与目的基因进行连接。例如，以质粒作为载体时，首先要选择出合适的限制性内切酶，对目的基因和载体进行切割，再以DNA连接酶使切口两端的脱氧核苷酸连接，于是目的基因被镶嵌进质粒DNA，重组形成了一个新的环状DNA分子（杂种DNA分子）。
1. 粘端DNA 间的连接 : 同一限制性内切酶切割位点连接、不同限制性内切酶切割位点连接
（3）DNA重组体的导入 把目的基因装在载体上后，就需要把它引入到受体细胞中。导入的方式有多种，主要包括转化、转导、显微注射、微粒轰击和电击穿孔等方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核生物细胞和酵母这样的低等真核生物细胞，其他方式主要应用于高等动植物的细胞。
（4）受体细胞的筛选 由于DNA重组体的转化成功率不是太高，因而，需要在众多的细胞中把成功转入DNA重组体的细胞挑选出来。应事先找到特定的标志，证明导入是否成功。
1、遗传表型直接筛选法
（1）根据载体选择标记初步筛选转化子
抗药性筛选、插入失活筛选、插入表达筛选、显色互补筛选
（2）营养缺陷型筛选
2、依赖重组子结构特征分析的筛选法
快速裂解菌落鉴定分子大小、限制性核酸内切酶分析法、利用PCR方法筛选重组子
DNA重组技术的原理
DNA重组技术是一种可以在实验室中修改DNA序列的方法，它已经在生物学和基因工程领域发挥了重要作用。本文将详细讨论该技术的原理、应用以及可能的发展方向。
1. DNA重组技术的基本概念
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA片段合并到一个新的DNA分子中，从而创造出具有新的特性的DNA分子的过程。这一技术可以在DNA分子水平上改变遗传信息，开辟了研究和利用基因的全新途径。
2. 受限酶与DNA重组技术
2.1 受限酶的作用原理
受限酶是一种能够识别特定DNA序列并切割DNA的酶。它们在大多数生物体中都有存在，并且具有高度的特异性。受限酶通过与目标DNA序列配对，形成酶-底物复合物，然后切割DNA，最终产生两个断片。
2.2 受限酶在DNA重组中的应用
在DNA重组过程中，受限酶是关键的工具之一。它们可以切割DNA并产生特定的粘性或平滑末端，使得不同DNA片段可以互相连接。通过选择合适的受限酶进行切割，可以实现DNA片段的精确拼接和重新组合。
3. DNA连接酶与DNA重组技术
3.1 DNA连接酶的作用原理
DNA连接酶是一种能够将两个DNA分子连接起来的酶。它们通过催化连接反应，在DNA分子的末端形成磷酸二酯键，从而将两个DNA分子牢固地连接在一起。 3.2 DNA连接酶在DNA重组中的应用
DNA连接酶在DNA重组中起到了至关重要的作用。通过使用合适的DNA连接酶，可以将经过切割的DNA片段精确地连接在一起。这种连接可以是同源连接，也可以是异源连接，为进一步的实验提供了更多灵活性。
4. 限制性修饰酶与DNA重组技术
4.1 限制性修饰酶的作用原理
限制性修饰酶是一类能够识别特定DNA序列并改变其结构或功能的酶。它们通过在目标DNA序列中引入特定的修饰，如甲基化或磷酸化，来改变DNA的可切割性或亲和性。
4.2 限制性修饰酶在DNA重组中的应用
限制性修饰酶可以通过改变DNA的切割特性，进一步调控DNA重组的过程。例如，通过甲基化修饰，可以使得某些DNA序列对受限酶的切割变得不敏感，从而实现对特定DNA片段的保护或选择性切割。
重组DNA技术
(总分：33.50，做题时间：90分钟)
一、A1型题(总题数：22，分数：22.00)
1.利用重组DNA技术发展新药物的叙述中，错误的是
A．在功能研究，基因克隆基础上进行
B．需构建适当的表达体系表达有生物活性的物质
C．需经过科学的动物实验
D．需进行严格的临床试验和药物审查
E．胰岛素和雌激素都可是重组DNA医药产品
（分数：1.00）
A.
B.
C.
D.
E. √
解析：
2.双脱氧末端终止法测序体系与PCR反应体系的主要区别是前者含有
A．模板
B．引物
C．DNA聚合酶
D．ddNTP
E．缓冲液
（分数：1.00）
A.
B.
C.
D. √
E.
解析：
3.关于重组DNA技术的叙述，错误的是
A．质粒、噬菌体可作为载体
B．限制性内切酶是主要工具酶之一
C．重组DNA由载体DNA和目标DNA组成
D．重组DNA分子经转化或转染可进入宿主细胞
E．进入细胞内的重组DNA均可表达目标蛋白
（分数：1.00）
A.
B.
C.
D.
E. √
解析：
4.不属于基因治疗方法的是
A．基因扩增
B．基因矫正
C．基因置换
D．基因增补
E．基因失活
（分数：1.00）
A. √
B.
C.
D.
E.
解析：
5.限制性内切酶是一种
A．核酸特异的内切酶
B．DNA特异的内切酶
C．DNA序列特异的内切酶
D．RNA特异的内切酶
E．RNA序列特异的内切酶
（分数：1.00）
A.
B.
C. √
D.
E.
解析：
6.关于用作基因载体的质粒的叙述，不正确是
A．是细菌染色体外的DNA分子 B．能在宿主细胞独立自主地进行复制
C．是双链线性分子
D．易从一个细菌转移入另一个细菌
E．常带抗药基因
第十三单元 重组DNA技术
第一节 重组DNA技术概述
一、重组DNA技术相关的概念
(一)克隆与克隆化 所谓克隆就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化，又称无性繁殖。克隆可以是细胞的，也可以是分子的。分子克隆专指DNA克隆。
(二)基因工程 亦称遗传工程，就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一复制子，继而通过转化或转染等导入宿主细胞(安全宿主菌)，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，又称基因克隆。“克隆”过程中，将外源DNA(感兴趣的DNA)插入载体分子所形成的复制子是杂合分子——嵌合DNA，所以DNA克隆、或基因克隆又称重组DNA。涉及上述操作过程的各项技术统称重组DNA技术或基因工程。
(三)工具酶 在基因工程技术中需要一些基本工具酶进行操作。例如，对基因或DNA进行处理时需利用序列特异的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA，使较大的基因片段或DNA分子成为较小的DNA片段；有时需在DNA连接酶催化下使较小的DNA片段连接成较大的DNA分子。此外，DNA聚合酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶和末端转移酶等也是基因工程技术中常用的工具酶。
限制性核酸内切酶就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶有三类，基因工程技术中常用的限制性内切酶为II类酶，例如Eco R I、Bam H I等就属于这类酶。大部分II类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈回文结构。有的限制性内切酶切割双链DNA后产生5’突出的粘末端，有的限制性内切割DNA后产生3’突出的粘末端或平端。无论何种内切酶、切割后产生何种末端，切割的DNA总是具有5’磷酸基和3’羟基基团。
