荧光、圆二色及共振光散射光谱研究熊果酸与牛血清白蛋白的相互作用

荧光、圆二色及共振光散射光谱研究熊果酸与牛血清白蛋白的相互作用丁兰;彭舒;柳志军;腾秀兰;令利军【摘要】利用荧光光谱(FS)、紫外吸收光谱(UV)、圆二色谱(CD)和共振光散射谱(RLS)研究熊果酸(UA)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用.荧光光谱显示,熊果酸能与BSA分子相结合,结合位点数为0.912 4,结合常数为0.693 4×103 L·m01-1,能量转移效率为0.036,结合距离为1.43 nm,并导致BSA荧光产生静态淬灭,其淬灭主要由色氨酸所贡献,并随熊果酸的浓度增高相应淬灭作用增强；紫外和圆二色光谱显示,熊果酸对BSA的紫外吸收峰具有增色效应,并减少BSA中α-螺旋含量,由56.72％减少至39.08％,使BSA的二级结构发生显著变化；共振光散射光谱显示,熊果酸使BSA分子聚集形成分子聚集体.【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(049)001【总页数】9页(P78-85,95)【关键词】熊果酸;牛血清白蛋白;荧光光谱;圆二色光谱;共振光散射【作者】丁兰;彭舒;柳志军;腾秀兰;令利军【作者单位】西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学化学化工学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】O657.3我国的香茶菜属植物（Radbosia）资源极为丰富，约有90余种，许多种类一直作为民间用药［1］，某些种类已经开发成为市售药［2］.迄今为止，已对约70多种香茶菜属植物进行了植物化学研究，研究表明，该属植物除了含有丰富的对映－贝壳杉烷类二萜化合物外，还含有大量的乌苏烷型和齐墩果烷型三萜类化合物，而熊果酸（UA）则是其中含量最为丰富的三萜酸之一［3］.熊果酸也大量存在于其它植物之中，如接骨木属、双蝴蝶属和桉属等，并且，从中分离得到的熊果酸被确定为这些植物保肝的有效成分［4］.此外，大量的研究证实熊果酸还具有抗炎［5］、抗HIV［6］、抑制细胞增殖［7］、诱导细胞凋亡［7］、抗癌［8］、抗氧化［9，19］和镇静［10］等药理活性.目前，含有丰富熊果酸的中草药在临床上大量使用［11］，但关于熊果酸的多种药理学机制还知之甚少.因此，在不同的研究层面以及利用不同的研究手段系统深入地研究熊果酸的相关作用机理，对于该化合物的深度开发和利用具有重要意义.蛋白质是最重要的生物大分子之一，在细胞内外有上千种之多，在生命活动中担负着众多功能.药物分子进入有机体后会与多种蛋白质分子相互作用，并通过特异性的靶蛋白发挥其药理学功能.牛血清白蛋白（BSA）是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它具有结合及运输内源和外源性物质的作用［12］，牛血清白蛋白与其它蛋白具有相似的基本单元结构，如氨基酸组成及二级结构，同时其高级结构也已阐明，因而它是研究高分子蛋白质理化性质、生物学功能的理想蛋白质［13，14］.紫外吸收光谱（UV）、荧光光谱（FS）、圆二色谱（CD）和共振光散射谱（RLS）等方法被广泛应用于蛋白质与小分子药物分子相互作用的研究［15］，从分子层面解析了药物分子对蛋白质结构的影响，这对于阐明药物分子的作用机理有重要意义.本课题组一直从事香茶菜属植物的植物化学［16］、抗癌［7，17］和抗氧化研究［18］. 从甘肃产香茶菜属植物中分离得到大量的熊果酸［19，20］，进一步的药理学研究表明，该化合物具有良好的抗癌细胞增殖、诱导凋亡及抗氧化能力［7，17，18］，这表明该化合物对于香茶菜属植物的抗癌活性具有较大的贡献.关于熊果酸与BSA相互作用的光谱学研究报道极少，仅有张璐颖等［21］运用荧光光谱研究了BSA与熊果酸结合反应中蛋白质的折叠变化型态以及金属离子Ni （Ⅱ）存在下的反应机制.本课题组在此基础上应用紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、共振光散射谱及其二维光谱，进一步研究了熊果酸对牛血清白蛋白的一级结构、二级结构的影响，为最终阐明该化合物的抗癌和抗氧化等药理学机制提供相关的分子相互作用信息.1 材料与方法1.1 仪器与试剂LS－55荧光分光光度计（美国PE公司）；UV－1800紫外分光光度计（日本岛津公司）；J－810型圆二色光谱仪（日本JASCO公司）；pHS－3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）.牛血清白蛋白（美国AMRESCO公司）用Tris－HCl缓冲溶液（10mmol·L－1，含有50mmol·L－1 NaCl以维持离子强度，pH＝7.4）分别配置成1×10－4 mol·L－1储备液和1×10－5 mol·L－1储备液，4℃保存.熊果酸由本实验室自甘肃产蓝萼香茶菜中分离得到［4］，分别用甲醇配置20mmol·L－1储备液，二甲基亚砜（DMSO）配置200mmol·L－1储备液，4℃保存，测试时用Tris－HCl缓冲溶液稀释使用；实验室用水为3次蒸馏水；其余试剂均为分析纯.1.2 实验方法1.2.1 紫外吸收光谱测定分别向10mL比色管中加入1mL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（甲醇溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组均含1%甲醇.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以含1%甲醇的Tris－HCl缓冲溶液为参比，扫描190～320nm波长范围内紫外吸收光谱.1.2.2 荧光光谱测定分别向10mL比色管中加入1mL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（因甲醇是荧光物质，对BSA荧光测定产生影响［20］，故选用DMSO作为熊果酸的助溶剂），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为2.5∶1，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组含0.1%DMSO.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以λex＝282nm为激发波长，狭缝宽Em＝Ex＝5nm，扫描300～450nm波长范围内的荧光光谱.1.2.3 同步荧光测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（DMSO溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1.每个测试组含0.1%DMSO.20 ℃ 孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以狭缝宽Δλ＝15nm，Em＝Ex＝10nm，扫描速度100nm·min－1，扫描260～350nm波长范围内的同步荧光；Δλ＝60nm，以狭缝宽Em＝Ex＝3.5nm，扫描速度100nm·min－1，扫描260～350nm波长范围内的同步荧光光谱.1.2.4 圆二色谱测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－5 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（甲醇溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组含0.1%甲醇.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以含有0.1%甲醇的Tris－HCl缓冲溶液作为参照，在200～250nm波长范围内进行扫描.1.2.5 共振光散射谱测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－5mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（DMSO溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1.每个测试组含0.03%DMSO.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以λex＝λem （Δλ＝0nm），狭缝宽度Ex＝10nm，Em＝20nm，扫描速度100nm扫描250～650nm波长范围的RLS谱.2 结果与讨论2.1 紫外吸光光谱蛋白质由20种常见氨基酸组成，在其紫外吸收光谱中，除芳香族氨基酸，如酪氨酸和苯丙氨酸以及含硫的氨基酸外，其余大部分氨基酸在230～310nm范围内没有吸收峰［22］.BSA在275nm处的特征吸收峰主要是由于BSA肽链中19个酪氨酸和2个色氨酸的芳杂环n－π＊和π－π＊跃迁引起的［23］.本实验以甲醇为助溶剂，各测试组均含1%甲醇，如图1所示，1%甲醇对BSA紫外吸光值有微弱影响.图2为BSA与熊果酸相互作用的吸收谱图，BSA在278nm处有紫外吸收峰.BSA溶液与不同浓度的熊果酸共同孵育1h后，BSA的紫外吸收峰均表现为明显的增色效应，并随着熊果酸浓度的提高其相应吸收峰的强度也增加.这可能是由于熊果酸使蛋白质肽链伸展，蛋白质内部氨基酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，疏水基团之间的疏水作用减弱，使得吸收峰强度增强［24］.图1 1%甲醇溶液与牛血清白蛋白相互作用的紫外吸收光谱Fig 1UV spectra of 1%methanol compounds－BSA solutions图2 熊果酸与牛血清白蛋白的紫外吸收光谱Fig 2Effect of ursolic acid on the absorption spectra of BSA2.2 荧光光谱2.2.1 荧光光谱色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这3种芳香族氨基酸荧光强度差异很大（100∶9∶0.5），这主要是由于它们结构的不同造成的［25］.由于色氨酸和酪氨酸在蛋白质中比例最大，荧光强度最大.因此，本实验主要研究熊果酸对BSA中这2种氨基酸的影响.因助溶剂甲醇荧光峰对BSA干扰较大［26］，故用DMSO作为助溶剂.测试样品中均含有0.1%DMSO，如图3所示，0.1%DMSO对BSA的荧光强度无影响.在浓度为1×10－5 mol·L－1的BSA溶液中加入不同量的熊果酸，测试BSA的荧光发射光谱，结果如图4所示.随着熊果酸浓度的增加，BSA的荧光发射强度逐渐下降，这表明BSA的荧光逐渐淬灭，且荧光的最大发生峰在342nm 附近，没有发生明显位移，该现象表明BSA与熊果酸发生了相互作用［27］.究其原因，极可能是BSA的空间构象发生变化导致氨基酸残基的疏水性降低而引起［28］.图3 0.1%二甲基亚砜与牛血清白蛋白的荧光光谱Fig 3Fluorsence spectra of0.1%DMSO compounds－BSA solutions图4 熊果酸与牛血清和白蛋白的荧光光谱Fig 4Effect of Ursolic acid on fluorescence spectra of BSA2.2.2 荧光淬灭方式溶液荧光的淬灭，是指荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学的作用过程.荧光物质分子同淬灭剂相互作用方式的差异，导致了不同的淬灭方式，如动态淬灭、静态淬灭和电荷转移淬灭等多种形式.静态淬灭是淬灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应所引起的一种淬灭过程；动态淬灭是淬灭剂和荧光物质的激发分子之间发生相互作用而引起的一种淬灭过程［29］.动态淬灭过程符合Stern－Volmer方程其中，F0是未加入淬灭剂时的荧光强度；F是加入淬灭剂后的荧光强度；Kq是双分子淬灭过程速率常数；KSV是Stern－Volmer动态淬灭常数；CQ是淬灭剂的浓度；τ0是淬灭剂不存在条件下生物大分子的平均荧光寿命（约为10－8 s）［30］.为确定熊果酸与BSA的淬灭机理，首先用Stern－Volmer方程处理，熊果酸与BSA荧光淬灭的F0／F与CQ的关系如图5所示.图5 熊果酸对牛血清白蛋白荧光淬灭的Stern－Volmer曲线Fig 5Stern－Volmer plots for fluorescene quenching of BSA由Stern－Volmer曲线计算得到，BSA的KSV＝0.135×104 L·mol－1（R＝0.983 8）.双分子淬灭过程速率常数Kq＝KSV／τ0，且无淬灭剂时生物大分子的平均荧光寿命τ0＝10－8 s［29］，＝0.135×1012 L·mol－1·s－1.由于生物大分子的最大动态淬灭常数为2.0×1010 L·mol－1·s－1［30］，本实验体系中双分子淬灭过程常数大于最大动态淬灭常数，说明熊果酸对BSA的淬灭是由于形成复合物而引起的静态淬灭［31］，这个结果同已报道的结果一致［21］.本实验得到的Kq值小于张璐颖等［21］报道的结果（K＝0.189 3×1013 L·mol－1·s－1），这可能主要归q咎于两者所选用测试缓冲溶液、助溶剂以及熊果酸的浓度存在差异.即本实验所用Tris－HCl缓冲溶液的浓度较之报道中的浓度小5倍，其中所含NaCl浓度也较之小2倍.2.2.3 熊果酸和牛血清白蛋白相互作用的结合位点数在静态淬灭过程中，荧光物质与淬灭剂分子之间的结合常数可以通过静态淬灭公式（2）计算：其中，F0是未加入淬灭剂时的荧光强度；F是加入淬灭剂后的荧光强度；K是结合常数；CQ是配合物的浓度；n是结合位点数.得到lg（F0／F－1）与lgCQ 的关系（图6）和相关方程：lg［（F0－F）／F］＝2.841＋0.912 4lgCQ（R＝0.981 07）.图6中曲线的斜率代表化合物与BSA的结合位点数n值，n＝0.912 4.而曲线的截距代表化合物与BSA的结合常数K 值，K＝0.693 4×103 L·mol－1.这个结果远小于已报道的结果［21］，本实验所使用的Tris－HCl缓冲溶液浓度较小，里面含有的NaCl浓度也较小，选用测试温度20℃，以上实验体系存在的差异，可能导致熊果酸与BSA相互作用结果存在较大差异.图6 lg（F0／F－1）与lgCQ 的关系Fig 6Plot of lg（F0／F－1）versus lg CQ 2.2.4 熊果酸－牛血清白蛋白的结合距离为了确定蛋白质与药物分子间的荧光发射残基的距离和能量转移效率，依据Fōster的非辐射能量转移机理［32，33］，对实验进行进一步分析.根据Fōster的理论，荧光发射体和荧光淬灭体之间的距离、临界能量转移距离和能量转移效率符合方程其中，E为能量转移效率；R0为临界能量转移距离；r为荧光发射体和荧光淬灭体之间的距离.R0－E＝50%时的临界能量距离.其中，K为偶极空间取向因子；N为介质的折射指数；φ为受体的光量子效率；J为授体荧光发射光谱与受体吸收光谱间的光谱重叠积分（cm3·L·mol－1）其中，F（λ）为荧光授体在波长λ处的荧光强度；ε（λ）为受体在波长λ处物质的能量吸收系数（L·（mol·cm）－1）.由公式（5）计算光谱重叠积分，JBSA＝1.46×10－18 cm3·L·mol－1.在本实验中，取偶极空间取向因子（K）为两结合物各向随机分布的平均值，即K2＝2／3［32］，光量子效率（φ）取色氨酸标准值，即φ＝0.13［34，35］，折射指数（N）分别取 N水＝1.33和N有机物＝1.39的平均值 N＝1.36［32］.将上述各数值带入（4）式可求得BSA临界能量距离R0＝0.56nm.由得到EUA－BSA＝0.036.由（3）式求得BSA中色氨酸残基与熊果酸之间的距离为rUA－BSA＝1.43nm.2.3 同步荧光光谱图7 牛血清白蛋白和熊果酸相互作用的同步荧光光谱Fig 7Synchronous fluorescence spectra with ursolic acid－BSA同步荧光光谱因其图谱简单、谱带窄、能够减少光谱重叠等优点，可用来研究小分子与蛋白质相互作用对蛋白质构象产生的影响［36］.Δλ＝15nm是酪氨酸残基的荧光，Δλ＝60nm是色氨酸残基的荧光.由图7可知，在Δλ＝60nm时（图7：A），BSA的同步荧光强度随着熊果酸浓度的逐渐增加而减小，而在Δλ＝15nm 时（图7：B），BSA的同步荧光强度随着熊果酸浓度的增加而增加，说明BSA 与熊果酸发生淬灭主要是色氨酸残基的贡献.2.4 圆二色谱BSA因其结构的不对称性而具有光学活性，圆二色谱（CD）是研究稀溶液条件下生物大分子二级结构的重要手段.蛋白质的CD光谱通常分为250～320nm的近紫外区CD光谱和178～250nm的远紫外区CD光谱.具有典型α－螺旋构象的分子其CD光谱在195nm处有正特征峰，在222nm和208nm处分别有负特征峰［37］（图8）.本实验主要通过对CD谱208nm处的特征峰强度进行计算，分析BSA与熊果酸相互作用时BSAα－螺旋的变化，进而推证熊果酸对BSA构象的影响.实验中使用含有0.5%甲醇作为助溶剂，该浓度的甲醇对BSA的CD光谱没有影响（图8）.由图9可知，伴随熊果酸浓度逐渐增加，BSA在208nm和222nm 处负峰的强度逐渐减小，说明BSA中α－螺旋发生了变化.由图8 0.5%甲醇溶液与BSA相互作用的圆二色谱Fig 8CD spectra of0.5%methanol compounds－BSA solutions图9 不同浓度的熊果酸与牛血清白蛋白相互作用的CD谱Fig 9Effect of ursolic acid on the CD of BSA计算出BSA二级结构中α－螺旋含量（表1）.表明随着熊果酸浓度逐渐增加，BSA的α－螺旋逐渐减少，BSA的构象变得疏松.表1 不同浓度熊果酸对牛血清白蛋白二级结构α－螺旋含量的影响Tab 1Affectof various concentrations of the ursolic acid on α－helix content of BSA’s secondary structure56.72 53.40 50.66 43.95 39.08 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 α－螺旋α－helix／%测试溶液Solutions n（Ursolic acid）∶n（BSA）BSA（2×10－7 mol·L－1）2.5 共振光散射谱共振光散射强度与体系电子密度起伏有关，通过共振散射强度可以表征聚合物体系的微观结构信息.这种方法常用于生物大分子的生化研究［38－41］.RLS光谱通常位于或是靠近分子吸收带，RLS信号的产生与溶液中形成聚集有关，其程度决定于溶液中粒子的直径［42］.本实验体系中含有0.03%DMSO，该浓度的DMSO对BSA的RLS强度有轻微影响.如图10所示，a谱线是BSA（2.0×10－7 mol·L－1）的RLS强度，b谱线是熊果酸（2.0×10－7 mol·L－1）的RLS强度，c到h谱线是BSA与不同浓度熊果酸相互作用的RLS强度.由图11可知450nm处有最大散射峰，随着熊果酸浓度逐渐增大，体系的RLS的强度也逐渐增大.可以说明，由于复合物的生成，BSA／熊果酸体系的RLS强度增大，并且随着熊果酸浓度的增大，BSA与熊果酸之间的结合越来越多.图10 0.03%二甲基亚砜与牛血清白蛋白的共振光散射谱Fig 10RLS spectra of 0.03%DMSO compounds－BSA solutions为了更进一步探究复合物大分子在外扰下，分子内各个官能团、结构单元发生变化的先后关系［42］，将光谱信号扩展到二维上分析.数据导入2Dshige 软件（2Dshige（C）Shigeaki Morita，Kwansei－Gakuin University，2004—2005）进行处理，分别计算得到二维同步和异步光谱（图12）.根据Noda的理论［44］，由同步二维光谱（图12（a））可知，在127nm，282nm，366nm处有自相关峰.结合RLS谱分析，外界扰动在366nm处有明显的变化.异步二维光谱（图12（b））中没有观察到明显的相关峰，可能是由于淬灭速率没有发生明显差别所造成的.二维谱分析说明，越靠近分子最大吸收处（366nm），RLS谱变化越快，分子间相互作用越强.图11 熊果酸与牛血清白蛋白的共振光散射谱Fig 11Effect of ursolic acid on the RLS of BSA图12 熊果酸与BSA相互作用的二维共振光散射光谱Fig 12 2DRLS correlation spectroscopy of the interaction of BSA and ursolic acid in different concentration3 结论利用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、共振光散射谱对从甘肃产蓝萼香茶菜中分离得到熊果酸与BSA相互作用进行了较为系统的分析.实验结果表明，熊果酸与BSA之间生成不发荧光的复合物而导致了静态淬灭，熊果酸与BSA之间的结合位点数为0.912 4，结合常数K值为0.693 4×103 L·mol－1，能量转移效率为0.036，结合距离为1.43nm.这些数据说明熊果酸与BSA相互作用结合距离较长，结合强度较弱，BSA与熊果酸相互作用主要是色氨酸的贡献.紫外和圆二色谱显示，熊果酸使BSA二级结构发生变化，α－螺旋显著减少，肽链伸展，疏水基团裸露，疏水作用减弱；同时，共振光散射实验证实，熊果酸还导致BSA分子间的聚集，在溶液中形成了较大的分子聚集体，RLS二维分析说明，越靠近366nm分子最大吸收处，分子间相互作用越强.这些实验结论在分子层面解释了熊果酸和BSA的相互作用规律，为最终阐明熊果酸的药理学机理提供了科学依据.参考文献：［1］孙汉董，许云龙，姜北.香茶菜属植物二萜化合物［M］.北京：科学出版社，2001.［2］冀春茹，袁珂，胡润淮，等.复方冬凌草含片的质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，1997，3（6）：7－10.［3］桂明玉，金永日，王宝珍.蓝萼香茶菜化学成分研究［J］.中国药学杂志，1999，34（8）：12－14.［4］LIU Jie.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid［J］.Journalof Ethnopharmacology，1995，49（2）：57－68.［5］CARLO F，MARIO P，GIORGIO P.Synthesis and anti－ul－cer activityof new derivarives of glyeyrrhetic，oleanolic and ursolic acids［J］.IL 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