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原子吸收分光光度法基本原理一. 原子吸收光谱的产生及共振线在一般情况下，原子处于能量最低状态（最稳定态），称为基态（E0= 0）。
当原子吸收外界能量被激发时，其最外层电子可能跃迁到较高的不同能级上，原子的这种运动状态称为激发态。
处于激发态的电子很不稳定，一般在极短的时间（10-8-10-7s）便跃回基态（或较低的激发态），此时，原子以电磁波的形式放出能量：(1)图1 原子光谱的发射和吸收示意图共振发射线：原子外层电子由第一激发态直接跃迁至基态所辐射的谱线称为共振发射线；共振吸收线：原子外层电子从基态跃迁至第一激发态所吸收的一定波长的谱线称为共振吸收线；共振线：共振发射线和共振吸收线都简称为共振线。
由于第一激发态与基态之间跃迁所需能量最低，最容易发生，大多数元素吸收也最强；因为不同元素的原子结构和外层电子排布各不相同，所以“共振线” 也就不同，各有特征，又称“特征谱线”，选作“分析线”。
二. 原子吸收值与原子浓度的关系（一）吸收线轮廓及变宽图2 基态原子对光的吸收若将一束不同频率，强度为I0 的平行光通过厚度为1cm的原子蒸气时，一部分光被吸收，(2)透射光的强度Iν仍服从朗伯-比尔定律：式中：Kν——基态原子对频率为的光的吸收系数，它是光源辐射频率的ν函数由于外界条件及本身的影响，造成对原子吸收的微扰，使其吸收不可能仅仅对应于一条细线，即原子吸收线并不是一条严格的几何线（单色λ），而是具有一定的宽度、轮廓，即透射光的强度表现为一个相似于下图的频率分布：图3 Iν与ν的关系若用原子吸收系数Kν随ν变化的关系作图得到吸收系数轮廓图：图4 原子吸收线的轮廓图①K0 ：峰值吸收系数或中心吸收系数（最大吸收系数）；②ν0：中心频率，最大吸收系数K0 所对应的波长；③∆ν：吸收线的半宽度，K0 /2 处吸收线上两点间的距离；④：积分吸收，吸收线下的总面积。
引起谱线变宽的主要因素有：1. 自然宽度：在无外界条件影响下的谱线宽度谓之根据量子力学的 Heisenberg 测不准原理，能级的能量有不确定量∆E，可由下式估算：τ—激发态原子的寿命，当τ为有限值时，则能级能量的不确定量∆E 为有限值，此能级不是一条直线，而是一个“带”。
原子吸收光谱法的主要干扰有物理干扰、化学干扰、电离干扰、光谱干扰和背景干扰等。
一、物理干扰物理干扰是指试液与标准溶液物理性质有差异而产生的干扰。
如粘度、表面张力或溶液的密度等的变化，影响样品的雾化和气溶胶到达火焰传送等引起原子吸收强度的变化而引起的干扰。
消除办法：配制与被测试样组成相近的标准溶液或采用标准加入法。
若试样溶液的浓度高，还可采用稀释法。
二、化学干扰化学干扰是由于被测元素原子与共存组份发生化学反应生成稳定的化合物，影响被测元素的原子化，而引起的干扰。
消除化学干扰的方法：（1）选择合适的原子化方法提高原子化温度，减小化学干扰。
使用高温火焰或提高石墨炉原子化温度，可使难离解的化合物分解。
采用还原性强的火焰与石墨炉原子化法，可使难离解的氧化物还原、分解。
（2）加入释放剂释放剂的作用是释放剂与干扰物质能生成比被测元素更稳定的化合物，使被测元素释放出来。
例如，磷酸根干扰钙的测定，可在试液中加入镧、锶盐，镧、锶与磷酸根首先生成比钙更稳定的磷酸盐，就相当于把钙释放出来。
（3）加入保护剂保护剂作用是它可与被测元素生成易分解的或更稳定的配合物，防止被测元素与干扰组份生成难离解的化合物。
保护剂一般是有机配合剂。
例如，EDTA、8-羟基喹啉。
（4）加入基体改进剂对于石墨炉原子化法，在试样中加入基体改进剂，使其在干燥或灰化阶段与试样发生化学变化，其结果可以增加基体的挥发性或改变被测元素的挥发性，以消除干扰。
三、电离干扰在高温条件下，原子会电离，使基态原子数减少，吸光度下降，这种干扰称为电离干扰。
消除电离干扰的方法是加入过量的消电离剂。
消电离剂是比被测元素电离电位低的元素，相同条件下消电离剂首先电离，产生大量的电子，抑制被测元素的电离。
例如，测钙时可加入过量的KCl溶液消除电离干扰。
钙的电离电位为6.1eV，钾的电离电位为4.3eV。
由于K电离产生大量电子，使钙离子得到电子而生成原子。
四、光谱干扰（1）吸收线重叠共存元素吸收线与被测元素分析线波长很接近时，两谱线重叠或部分重叠，会使结果偏高。
共振光散射光谱测定
共振光散射（Resonance Light Scattering，RLS）是一种用于分析样品的光散射技术。
它利用样品中某些特定分子或物质与特定波长的光产生共振效应，进而引起散射光的增强现象。
这种技术在分析化学和生物化学等领域有着广泛的应用。
共振光散射光谱测定的原理基于样品中某些分子或物质与特定波长的光相互作用的结果。
当光线与样品中特定分子的共振波长相匹配时，样品会吸收光的能量，然后以散射光的形式重新辐射出来。
这种重新辐射会导致散射光的强度增加，形成共振光散射峰。
这种峰的出现可以用于检测和定量分析样品中特定物质的存在和浓度。
共振光散射光谱测定常常需要精确控制光源、检测器和样品的制备条件。
通过测量散射光的强度、波长和特征峰来分析样品中特定物质的含量或性质。
这种技术在生物化学、药物分析、环境监测等领域具有重要的应用价值。
要进行共振光散射光谱测定，通常需要专门的光学仪器和精确的样品处理技术。
研究人员通常需要了解样品的特性，并采用合适的波长和实验条件来实施测定。
具体的实验步骤和分析方法会根据不同的应用领域和样品类型而有所不同。
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共振光散射技术
共振光散射技术是一种研究散射现象的技术，它涉及到光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光学现象。
该技术利用共振瑞利散射(Resonance Rayleigh Scattering, RRS)的原理，当光与分子发生弹性碰撞时会产生瑞利散射，即散射光波长等于入射光波长。
在共振光散射中，当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射。
共振光散射技术常用于研究半径很小的散射粒子，其光散射信号主要成分是共振瑞利散射。
该技术具有广泛的应用前景，在胶体化学和高分子溶液研究方面有广泛的应用。
例如，它可以用于测定聚合物的聚集行为，以及研究生物大分子的装配、超分子排列和生物大分子的测定等。
共振光散射光谱的测定通常在较大的激发和发射单色器狭缝宽度（≥5nm）下进行，在此情况下所获得的共振光散射光谱中含有动态光散射成分。
另外，当散射体系中含有较大的散射粒子或能发射Stokes很小的荧光组分时，共振光散射信号还含有Tyndall散射和荧光等信号。
因此，通常获得的共振光散射光谱并非单纯的共振瑞利散射，还有动态光散射、Tyndall散射及荧光等信号。
总之，共振光散射技术是一种利用光学手段研究物质性质的重要技术，其应用前景广泛，特别是在生物大分子和胶体化学等领域有重
要作用。
共振光散射相关光谱
共振光散射相关光谱是一种结合了共振光散射（RLS）技术和相关光谱分析方法的先进光学技术。
该技术主要用于研究溶液中纳米颗粒、分子聚集体以及其他散射体的动态行为和相互作用。
在共振光散射过程中，当入射光的频率与散射体的电子跃迁频率相匹配时，散射体对光的散射作用会显著增强。
这种增强效应使得共振光散射成为一种高灵敏度的检测技术，特别适用于研究低浓度的纳米颗粒和分子聚集体。
相关光谱分析方法则是通过分析散射光强度随时间变化的自相关函数来获取有关散射体动态行为的信息。
这种方法可以揭示散射体在溶液中的扩散系数、粒径分布以及可能的聚集状态等。
共振光散射相关光谱技术结合了共振光散射的高灵敏度和相关光谱分析方法的高分辨率，使得该技术在研究纳米颗粒和分子聚集体的动态行为、相互作用以及生物大分子的结构和功能等方面具有独特的优势。
例如，该技术可用于实时监测生物大分子与药物分子之间的相互作用，为药物筛选和设计提供有力支持。
此外，共振光散射相关光谱还可用于环境监测、食品安全检测以及材料科学等领域的研究。
共振瑞利散射光谱法测定药物中的盐酸氯丙嗪王晓玲;刘建波;张萍【摘要】在pH值为3.6的邻苯二甲酸氢钾-HCl缓冲溶液中,盐酸氯丙嗪与伊红Y(醇溶)反应生成的荷移络合物在321 nm处会产生强烈的共振瑞利散射.基于此,建立了测定盐酸氯丙嗪的共振瑞利散射光谱法,并对缓冲溶液及其用量、伊红Y用量、反应温度、反应时间、加样顺序等条件进行了优化.结果表明,在优化条件下,盐酸氯丙嗪的质量浓度在0～15 μg·(10 mL)-1范围内与△I呈良好的线性关系,检出限为2.6 μg·L-1,加标回收率在98.7％～103.3％之间,相对标准偏差为0.18％～0.69％.该方法简便、快速、灵敏度高、选择性好,可用于药物制剂中痕量盐酸氟丙嗪的测定.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2018(035)010【总页数】4页(P60-63)【关键词】共振瑞利散射光谱法;伊红Y;盐酸氯丙嗪;电荷转移反应【作者】王晓玲;刘建波;张萍【作者单位】咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳712000;咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳712000;咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳712000【正文语种】中文【中图分类】O657盐酸氯丙嗪(CPZ)，又名冬眠灵，主要作为抗组胺药和安静剂使用，临床上有安静、催眠、抗精神失常和特殊的中枢抑制作用，是目前抗精神病的首选药。
目前文献报道的盐酸氯丙嗪的测定方法主要有分光光度法[1-3]、化学发光法[4-5]、荧光法[6]、HPLC法[7]、共振瑞利散射法[8]等，其中，共振瑞利散射法具有选择性好、灵敏度高、操作简单等特点，在药物分析领域极具应用潜力。
在pH值为3.6的邻苯二甲酸氢钾-HCl缓冲溶液中，盐酸氯丙嗪与伊红Y(醇溶)反应生成的荷移络合物在321 nm处会产生强烈的共振瑞利散射(RRS)。
基于此，作者建立了测定盐酸氯丙嗪的共振瑞利散射光谱法，测试了伊红Y与不同浓度盐酸氯丙嗪相互作用产生的共振瑞利散射光谱，并对缓冲溶液及其用量、伊红Y用量、反应温度、反应时间、加样顺序等条件进行了优化，以期拓展共振瑞利散射技术在药品分析领域的应用，创建盐酸氯丙嗪类药物分析新方法。
第29卷2001年7月 分析化学(FE NXI H UAX UE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第7期832～835共振光散射光谱的校正黄承志3 李原芳 奉 萍(西南师范大学环境化学研究所,重庆400715)摘 要 以罗丹明6G 在pH 7.40时的共振光散射光谱(R LS )为例,引进仪器特性因子和分子吸收因子讨论荧光分光光度计的检测灵敏度和体系分子吸收对R LS 光谱的影响,提出光谱校正方程。
在吸收体系中,吸收带附近的散射光强度降低,并导致散射光谱发生畸变。
通过光谱校正,除消除了不同仪器因光源和检测系统的差异对R LS 光谱特性影响外,有效地消除了分子吸收的影响,提高了测定灵敏度。
关键词 罗丹明6G,共振光散射,光谱校正 2000208225收稿;2001202212接受本文系国家自然科学基金(29875019)、教育部优秀年轻教师基金(2000211)和重庆市应用基础研究资助项目1 引 言使用普通荧光分光光度计可以十分方便地获得分子散射光谱〔1,2〕,能十分灵敏地测定因发生了分子组装或聚集的生物大分子物质〔3～5〕,表征分子染料在表面活性剂或生物大分子存在下的聚集等〔6,7〕。
在我们的研究过程中发现,影响R LS 光谱的因素很多,例如仪器灵敏度,反应前后粒子大小,分子的吸收等,使用不同的仪器将获得不同特征的R LS 光谱,甚至R LS 光谱的特征波长都将发生变化,无疑需要对R LS 光谱进行校正以后才能获得真正的R LS 光谱特征。
Borissevitch 〔8,9〕和姚钢等〔10.11〕讨论了卟啉分子聚集和偶氮磺∆与蛋白质作用过程中R LS 光谱校正。
在此基础上,本文以罗丹明6G 的R LS 特征为例,结合理论推导,讨论了由于仪器灵敏度和体系吸收对R LS 特征的影响。
2 实验部分2.1 仪器和试剂F 24500型荧光分光光度计(日本日立公司),pH 计(美国Orion 公司)。
4.0×10-4m ol/L 罗丹明6G (Rh6G )溶液。
T ris 2HCl 缓冲溶液(pH =7.40)。
使用二次蒸馏水,所用试剂均为分析纯。
2.2 试验方法在10m L 比色管中加入一定体积的4.0×10-4m ol/L Rh6G 溶液和1.0m L T ris 2HCl 缓冲溶液,用二次蒸馏水稀释至刻度,混合均匀后于荧光光度计上于λem =λex 处进行同步扫描获得RLS 光谱,每间隔3.0nm 取得R LS 强度数据,荧光分光光度计的激发和发射狭缝始终保持在5.0nm ,试验在24～26℃下进行。
R LS 数据经450nm 归一化后使用Origin 5.0软件处理,获得体系的归一化R LS 光谱。
3 结果与讨论3.1 非吸收体系的R LS 光谱校正当我们使用普通荧光光度计检测没有光吸收的溶液时,可以通过积分在激发(X )和发射(Y )光方向溶液被照射高度为Z 0的体积微元d x d yZ 0获得:I ms =κβI 0d x d y Z 0(1)其中I ms 是没有光吸收溶液的光散射强度,β是比例系数,I 0是入射光强度,d x 和d y 分别是在X 和Y 方向的分部微分,Z 0是激发光在Z 方向上光束所能照射到的溶液高度,由仪器性质所决定,为一个常数,因此,积分式(1)得:I ms =βI 0X 0Y 0Z 0(2) 但在各向同性非吸收体系中,光散射强度遵守Rayleigh 散射定律,与入射波长的四次方成反比。
因此,所获得的光散射信号I ms 对Rayleigh 散射定律的偏离源于仪器的光源特性和检测灵敏度,如果仪器参数稳定,则仪器参数S (λ)仅与波长有关,即:S (λ)=I msR (λ)(3)式中S (λ)是仪器随波长变化的仪器参数,体现了光源的能量发射和检测器对不同光波长信号的响应,为讨论方便,我们都使用在450nm 处归一化的Rayleigh 散射光谱R (λ)和测定的非吸收体系的散射光谱I ms (λ)。
因此在对仪器于不同波长处的灵敏度进行校正后,获得非吸收体系的校正R LS 光谱,如果使用1cm 厚度的比色池,则式(3)为:I C orr (λ)=I ms (λ)S (λ)=βI 0Z 0S (λ)(4)式中I C orr (λ)是校正后的光散射信号。
通过进行式(4)的光谱校正后获得仪器校正曲线λ2S (λ),如图(1) 图1 空白(缓冲)溶液的R LS 光谱(●)、Rayleigh 理论散射光谱(■)和F 24500荧光分光光度计仪器校正因子S (λ)(▲) Fig.1 res onance light scattering (R LS )spectra of blank s o 2lution (bu ffer )(●),calculated rayleigh light scattering (■),and instrument correction factor of F 24500spectrofuorometer (▲)。
所示,F 24500荧光分光光度计在500～580nm 区域有较好的稳定性,而在其他区域校正因子变化较大。
这些变化来源于仪器本身,如光源的能量发射系统和仪器的信号检测系统。
对于一台确定的仪器,在仪器工作条件稳定的情况下,式(4)所表示的各项参数是恒定的,所以图1所示的非吸收溶液体系的λ2S(λ)曲线不应发生变化。
3.2 吸收体系的R LS 光谱校正对于有光吸收的体系,有两个因素导致检测到的光散射信号偏离Rayleigh 散射定律,其一是分子吸收了激发光和发射的散射光使得实际检测到的散射光强度降低,其二是在分子吸收带附近由于折光指数的迅速变化而导致光散射增强〔1,2〕。
在各向同性介质中,分子吸收因素掩盖了光散射因素,表现出光散射信号随吸收成分浓度增大而降低。
但当体系中有集聚体存在时,光散射增强与散射粒子大小的平方根成正比,这时将观察到强烈的共振光散射增强信号。
因此从纯粹考虑的光散射增强的角度,有必要校正分子吸收导致的散射信号降低。
在吸收体系中,光散射强度同样可以通过积分在激发(X )和发射(Y )光方向溶液被照射高度为Z 0的体积微元d x d yZ 0获得。
当强度为I 0的入射光通过厚度为x 的溶液吸收后到达体积微元的光强度I x 为:I x =I 010-εxc (5) 其中ε为溶液的摩尔吸光系数,c 为吸收溶液的浓度,x 为X 方向比色池内表面到体积微元的距离。
因此体积微元在受到强度为I x 的激发光激发时产生的散射光强度为:d (I x )=βI x d x d y Z 0(6) 在垂直于激发光束Y 方向上仪器能检测到体积微元d x d yZ 0所发射的光散射强度由于分子吸收会降低,故最终检测到的散射信号强度为:d (I abs ms )=d (I x )10-εxc =βΙ0Z 010-εxc 10-εyc (7)其中I abs ms 为吸收体系的光散射强度,y 为Y 方向体积微元到比色池内表面的距离。
对体积微元d x d yZ 0的散射光强度d (I abs ms)进行积分,将获得垂直于激发光束的Y 方向上的光散射强度,即338第7期黄承志等:共振光散射光谱的校正 I abs ms =βI 0Z 0∫X 00(10-εxc )dx ∫Y 00(10-εyc )dy (8)积分得I abs ms=βI 0Z 0(1-10-εcX 0)(1-10-εcY 0)(εc ln10)2(9)如果比色池厚度为1cm ,在数值上有A =εcX 0=εcY 0=εc ,并引入式(3)得,I abs ms =I ms 1-10-A 2.303A 2(10)式(10)中的括号项表明了光吸收带来的影响。
为了消除光学吸收对光散射的影响,我们必须引进吸收校正因子A (λ),A (λ)=2.303A 1-10-A2(11)从吸收校正因子可以看出,如果溶液吸收越弱,A (λ)越低,对散射强度的影响越小;但溶液的吸收越强,A (λ)越大,光学吸收对R LS 强度的降低将更加明显。
显然,此时由于吸收对光散射测定的灵敏度影响不能忽略。
当一个吸收体系在同时进行仪器特性和光学吸收校正后,获得校正光谱为I C orr =A (λ)S (λ)・I abs ms (12)通常情况下,对于同一台仪器,由于S (λ)恒定,如果只是进行定量分析,而不进行光谱研究,就没有必 图2 Rh6G 的分子吸收光谱 Fig.2 M olecular abs orption of rhodamine 6G (Rh6G ) 浓度(C oncentration ,×10-5m ol/L ):0.4,0.8,1.6,pH 7140。
以对应的缓冲溶液为空白(against bu ffer s olution )。
要再作仪器性能校正,只需作A (λ)校正。
对于一个强的光学吸收体系,在作了A (λ)校正以后,I C orr 将增大,有利于提高分析灵敏度。
3.3 Rh6G 的分子吸收、共振光散射光谱和校正共振光散射光谱如图2是Rh6G 的分子吸收光谱。
在pH 7.40下特征吸收位于527.2nm ,在492nm 处有一个肩峰。
低于1.6×10-5m ol/L 浓度的Rh6G 没有峰位移产生,分子的特征吸收符合Beer 定律。
但在相同条件下,R LS 光谱具有独特的性质。
如图3所示的R LS 是归一化的R LS 光谱。
与分子吸收光谱不同的是,Rh6G 的R LS 光谱随着浓度增大的R LS 增强具有特征峰位移,红移倾向十分严重,并且R LS 强度与其浓度之间没有线性关系。
在对如图(3)的R LS 光谱进行式(12)所示的溶液吸收校正以后,我们获得校正R LS 光谱,如图4所示,校正R LS 光谱与没有校正的R LS 光谱相比,具有以下特征:(1)校正R LS 光谱特征峰位于537nm ,位于分子吸收右侧约10nm 处;(2)Rh6G 的浓度变化不导致特征校正R LS 峰位移;(3)在特征R LS 峰处,校正R LS 强度与浓度具有线性关系:I abs C orr =-2.98+145.47c (r =0.9952;n =4;c ,10-5m ol/L )。
所以,图(3)中R LS 光谱的峰位移是由于分子吸收造成的。
由于分子吸收同时激发和散射光,导致散射光谱发生畸变,强度与浓度不成线性关系。
438 分析化学第29卷 图3 Rh6G的归一化R LS Fig.3 N ormalized R LS spectra of Rh6G浓度(concentration ,×10-5m ol/L ),从上至下(from top to bottom ):1.6,0.8,0.4,0.0,pH 7.40。
