覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案
1、目的
本试验对覆盆子鉴别与含量测定检验方法进行确认，为了确保检验数据的科学性、准确性和可靠性，制定本确认方案，以确定建立的鉴别与含量测定检验方法能够对该产品进行准确的检验，为我司化验室以后的覆盆子检验方法提供依据。
2、范围
本方案适用于我公司覆盆子鉴别与含量测定检验方法的确认。
4、确认依据文件
《中国药典》2015年版
5、确认程序
5.1先决条件的确认
5.1.1仪器经过校准确认
所需仪器经过校准并在有效期内，确认记录见附表01。
5.1.2.人员培训确认
确认小组人员参加了本方案的培训，以及仪器的操作、维护和保养培训、偏差处理、变更控制等SOP的培训，确认记录见附表02。
5.1.3相关SOP的确认
制定仪器操作、校验、维护和保养标准程序并批准，确认记录见附表03。
5.1.4药品的确认
确认方案确认过程中使用的药品符合规定，并在有效期内。确认记录见附表04。
5.2鉴别方法学确认
专属性：
供试品溶液制备取山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定项下供试品溶液，即得。
对照品溶液制备取椴树苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
阴性溶液制备照供试品溶液制备方法除取样品外，同法制成阴性溶液。
测定照《薄层色谱法标准操作规程》试验，吸取上述供试品溶液与阴性溶液各5μl，及对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（90∶4∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，在105℃加热5分钟，在紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性液在相应位置上不显斑点（见薄层色谱图05-1）。
确认记录见附表05。
5.3含量测定方法学确认
5.3.1鞣花酸含量测定
5.3.1.1检查方法：照《高效液相色谱法标准操作规程》测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml 含5μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置5ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含鞣花酸（C14H6O8）不得少于0.20%。
5.3.1.2系统适用性确认
5.3.1.2.3试验操作
待仪器稳定后，按下列进样序列注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以鞣花酸峰面积计算5针对照品溶液1的RSD；按外标法以对照品溶液1的鞣花酸峰面积计算
5.3.1.2.4系统适用性回收率
按以下公式计算对照品溶液2的回收率：
%100c 221112121⨯⨯⨯⨯⨯=
R R R R R R R C M A C M A R
%100c 2
211
12222⨯⨯⨯⨯⨯=R R R R R R R C M A C M A R
式中： A R1、A R21、A R22：分别为对照品溶液1连续5针的平均峰面积和对照品溶液2第一针和第二针的峰面积；
M R1、M R2：分别为对照品1、2的称样量； C R1和C R2：分别为对照品1、2中鞣花酸的含量；
Rc R21和Rc R22：分别为对照品溶液2第1针和第2针的回收率； 5.3.1.2.5可接受标准
5针对照品溶液1鞣花酸主峰的保留时间的RSD 均不大于2.0%，鞣花酸主峰面积的RSD 均应不大于1.0%；对照品溶液2的回收率应在98.0%～102.0%。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。
注：若系统适用性不符合标准应立即停止进样，排查原因后再重做系统适用性，系统适用性合格后方可进行如下试验。确认记录见附表06。 5.3.1.3含量测定 5.3.1.3.1操作
系统适用性合格后，接着系统适用性进样序列取供试品溶液1、2，用0.45um （尼龙66）一次性针式过滤头弃去5ml 后取续滤液，进样，进样序列如下（序号4、5、6）：
注：在对照品溶液1运行完成后一般间隔10针（以时间最短的计）后，应重新插入2针对照品溶液1，作为系统跟踪，以此来评价系统稳定性。 5.3.1.3.2计算
综合前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算鞣花酸峰面积的RSD ，当RSD 不大于2.0%时，按以下公式计算覆盆子的含量：
%100%1/%⨯⨯-⨯⨯=
稀释倍数
）水分（供试品重量对照品浓度
对照品峰面积供试品峰面积含量
注：综合供试品溶液的前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算鞣花酸峰面积的RSD 不符合规定时，应排查原因后，再按5.3.1.2项重新测定。 5.3.1.3.3可接受标准：
按干燥品计算，含鞣花酸（C 14H 6O 8）不得少于0.20%。确认记录见附表06。 5.3.2山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定
5.3.2.1检查方法：照《高效液相色谱法标准操作规程》测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）为流动相；检测波长为344nm 。理论板数按山柰酸-3-O-芸香糖苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 取山柰酸-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成每1ml 含80μg 的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约1g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml ，称定重量，加热回流提取1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml ，蒸干，残渣加水20ml 使溶解，用石油醚振摇提取3次，每次20ml ，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20ml ，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含山柰酸-3-O-芸香糖苷（C 27H 30O 15）不得少于0.03%。 5.3.2.2系统适用性确认
