酶盐析法生产工艺

胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。

其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。

纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。

综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。

关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。

一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。

（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。

用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。

（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。

（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。

球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。

通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。

当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。

丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。

2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。

酶的生产和利用一、微生物酶制剂的生产主要有以下步骤：1、目的酶生产菌株的分离筛选（1）从自然界分离筛选（2）用物理、化学因子处理诱变（3）用基因重组或细胞融合技术选育2、酶的生产（1）要选择好的培养方法，包括培养基组成配比、培养温度、pH 值、通气量等。

图:微生物在相当于三层楼高的发酵罐里生长繁殖，产生所需的酶（2）确定工业规模大量生产的一系列工程和工艺条件，以及培养罐的形式、大小、通气条件、温度和pH 值的控制等。

图：通过改变培养基类型、酸碱度、氧气浓度和温度，研究人员现了生产某种酶的微生物的最佳生长条件。

三、酶的提取、分离和纯化1、微生物酶制剂的工业提取步骤大致如下：如果是胞内酶，则首先要分离收集其菌体，使之破碎，将酶提取至液相中，此为出发酶液；如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。

2、制取工业酶制剂的步骤：第一步——除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清酶液，必要时再进行减压浓缩；第二步——根据质量要求和经济性采用适当方法（如用盐析法、有机溶剂沉淀法、丹宁沉淀法等）将酶沉淀分离；图：只有酶和水能通过转鼓式过滤机；培养基和微生物则被留在硅藻土上。

第三步——收集沉淀、干燥、研粉、加适当的稳定剂、填充剂、做成粉末制剂。

••酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。

提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。

然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。

图:用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。

3、其他方法对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。

常用的方法有：（ 1 ）蛋白质选择性变性法（ 2 ）分级盐析法•有机溶剂分级沉淀法•等电点法•柱层析法•电泳法•亲和层析法四、酶的化学修饰技术1、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰3、肽链有限水解修饰4、侧链修饰图：微生物的基因经修饰能够产生所需的酶五、固定化酶和固定化细胞固定化酶是通过物理或化学的处理，使水溶性酶和固态的水不溶支持物（载体）相结合或被载体包埋，但仍保留酶活力。

蛋白酶的盐析沉淀实验报告班级：生工1005 学号：00 姓名：朱同辉实验目的：1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的计算方法。

实验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。

原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。

盐析效果： 二价离子 > 一价离子离子半径小 > 离子半径大阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度β—常数，与温度和pH 有关Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关其中I 根据下式计算：式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。

蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为108.53680D .O N K 104⨯⨯⨯=酶活力IK S log s -β=2ii z c 21I ∑=N—酶液稀释倍数4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以410—反应时间为10 min参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍实验步骤：1）蛋白质盐析分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。

纤维素酶的生产工艺及分离提纯：朱帅帅学号：4 四院三连通信工程摘要：纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。

由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国外业人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。

关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract：Cellulase is an important enzyme products, a plex enzyme, mainly by the exo-β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase and other ponents, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial enzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to bee the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can depose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.Keywords:Fermentation, Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.一、纤维素酶的概述纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。

盐析法沉淀酶”通常指的是利用盐析法对酶进行提纯和分离的方法。

盐析法是一种常见的蛋白质分离技术，通过调节盐浓度使蛋白质发生沉淀，从而实现蛋白质的提纯和富集。

在酶学中，盐析法通常用于酶的富集和提纯过程。

一般步骤如下：
1.溶液制备：将含有酶的混合物在适当的缓冲液中溶解，并去除杂质。

2.盐析操作：逐渐加入盐类（如硫酸铵）至溶液中，使得蛋白质发生沉淀。

通过盐的逐渐
加入，可以控制沉淀的蛋白质种类和纯度。

3.沉淀收集：将沉淀的蛋白质用离心或其他方法分离出来。

4.溶解和保存：将沉淀的酶溶解在适当的缓冲液中，根据需要进行进一步的纯化和储存。

这种方法能够根据酶的生物化学特性和蛋白质的溶解度进行选择性分离，是酶学研究和工业生产中常用的一种技术手段。

酶法生产工艺酶法生产工艺是一种利用酶催化反应来进行生物转化的工艺。

酶作为生物催化剂，具有高效、特异、温和等优点，因此在工业生产中应用广泛。

下面将介绍一种常见的酶法生产工艺。

以酶法生产果糖为例：1. 原料准备：选择含有果糖的寡糖、低聚糖或淀粉等作为原料，将其进行粉碎、过筛等处理，以提高反应效率。

2. 酶制剂配方：根据反应需要，选择适当的酶制剂，比如果糖酶。

将酶制剂与适量的辅助物质如缓冲剂、金属离子等按一定比例混合，制成酶液。

3. 反应装置：选择合适的反应装置，如发酵罐、反应釜等。

根据反应规模和条件要求，进行装置的设计和选型。

4. 反应条件控制：调节反应温度、pH值、酶浓度等反应条件，以最大限度地提高反应效率和产物纯度。

5. 反应操作：将原料添加到反应装置中，加入预先配制好的酶液，通过搅拌等方式促进反应进行。

控制反应时间和反应速率，使反应充分进行。

6. 反应结束：根据反应时间或反应物浓度的变化，确定反应结束时机。

停止反应，通过加热、调节pH值等方式使酶活性失活，停止反应过程。

7. 分离纯化：将反应产物与反应物、副产物等进行分离。

常用的分离纯化方法有过滤、离心、溶剂萃取、蒸馏等。

8. 产品收集：收集分离纯化后的果糖产物，进行检测和分析，判断产品质量和含量。

9. 后续处理：对产品进行进一步的加工和处理，如浓缩、干燥、粉碎等，以得到符合要求的最终产品。

10. 废弃物处理：对反应过程中产生的废弃物进行处理，以减少环境污染和资源浪费。

酶法生产工艺具有操作简便、生产周期短、反应条件温和等优点，广泛应用于食品工业、制药工业、化工工业等领域。

随着生物技术的不断发展，酶法生产工艺在未来将拥有更广阔的应用前景。

四、酶的提取技术1、酶提取的方法（1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。

但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。

一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。

以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。

在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。

如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。

同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。

分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。

盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。

盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。

用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。

（2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清楚。

各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。

乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。

有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。

分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。

按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。

由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。