酶盐析法生产工艺

胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。

其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。

纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。

综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。

关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。

一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。

（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。

用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。

（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。

（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。

球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。

通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。

当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。

丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。

2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。

酶的生产和利用一、微生物酶制剂的生产主要有以下步骤：1、目的酶生产菌株的分离筛选（1）从自然界分离筛选（2）用物理、化学因子处理诱变（3）用基因重组或细胞融合技术选育2、酶的生产（1）要选择好的培养方法，包括培养基组成配比、培养温度、pH 值、通气量等。

图:微生物在相当于三层楼高的发酵罐里生长繁殖，产生所需的酶（2）确定工业规模大量生产的一系列工程和工艺条件，以及培养罐的形式、大小、通气条件、温度和pH 值的控制等。

图：通过改变培养基类型、酸碱度、氧气浓度和温度，研究人员现了生产某种酶的微生物的最佳生长条件。

三、酶的提取、分离和纯化1、微生物酶制剂的工业提取步骤大致如下：如果是胞内酶，则首先要分离收集其菌体，使之破碎，将酶提取至液相中，此为出发酶液；如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。

2、制取工业酶制剂的步骤：第一步——除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清酶液，必要时再进行减压浓缩；第二步——根据质量要求和经济性采用适当方法（如用盐析法、有机溶剂沉淀法、丹宁沉淀法等）将酶沉淀分离；图：只有酶和水能通过转鼓式过滤机；培养基和微生物则被留在硅藻土上。

第三步——收集沉淀、干燥、研粉、加适当的稳定剂、填充剂、做成粉末制剂。

••酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。

提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。

然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。

图:用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。

3、其他方法对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。

常用的方法有：（ 1 ）蛋白质选择性变性法（ 2 ）分级盐析法•有机溶剂分级沉淀法•等电点法•柱层析法•电泳法•亲和层析法四、酶的化学修饰技术1、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰3、肽链有限水解修饰4、侧链修饰图：微生物的基因经修饰能够产生所需的酶五、固定化酶和固定化细胞固定化酶是通过物理或化学的处理，使水溶性酶和固态的水不溶支持物（载体）相结合或被载体包埋，但仍保留酶活力。

蛋白酶的盐析沉淀实验报告班级：生工1005 学号：00 姓名：朱同辉实验目的：1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的计算方法。

实验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。

原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。

盐析效果： 二价离子 > 一价离子离子半径小 > 离子半径大阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度β—常数，与温度和pH 有关Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关其中I 根据下式计算：式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。

蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为108.53680D .O N K 104⨯⨯⨯=酶活力IK S log s -β=2ii z c 21I ∑=N—酶液稀释倍数4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以410—反应时间为10 min参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍实验步骤：1）蛋白质盐析分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。

纤维素酶的生产工艺及分离提纯：朱帅帅学号：4 四院三连通信工程摘要：纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。

由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国外业人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。

关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract：Cellulase is an important enzyme products, a plex enzyme, mainly by the exo-β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase and other ponents, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial enzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to bee the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can depose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.Keywords:Fermentation, Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.一、纤维素酶的概述纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。

盐析法沉淀酶”通常指的是利用盐析法对酶进行提纯和分离的方法。

盐析法是一种常见的蛋白质分离技术，通过调节盐浓度使蛋白质发生沉淀，从而实现蛋白质的提纯和富集。

在酶学中，盐析法通常用于酶的富集和提纯过程。

一般步骤如下：
1.溶液制备：将含有酶的混合物在适当的缓冲液中溶解，并去除杂质。

2.盐析操作：逐渐加入盐类（如硫酸铵）至溶液中，使得蛋白质发生沉淀。

通过盐的逐渐
加入，可以控制沉淀的蛋白质种类和纯度。

3.沉淀收集：将沉淀的蛋白质用离心或其他方法分离出来。

4.溶解和保存：将沉淀的酶溶解在适当的缓冲液中，根据需要进行进一步的纯化和储存。

这种方法能够根据酶的生物化学特性和蛋白质的溶解度进行选择性分离，是酶学研究和工业生产中常用的一种技术手段。

酶法生产工艺酶法生产工艺是一种利用酶催化反应来进行生物转化的工艺。

酶作为生物催化剂，具有高效、特异、温和等优点，因此在工业生产中应用广泛。

下面将介绍一种常见的酶法生产工艺。

以酶法生产果糖为例：1. 原料准备：选择含有果糖的寡糖、低聚糖或淀粉等作为原料，将其进行粉碎、过筛等处理，以提高反应效率。

2. 酶制剂配方：根据反应需要，选择适当的酶制剂，比如果糖酶。

将酶制剂与适量的辅助物质如缓冲剂、金属离子等按一定比例混合，制成酶液。

3. 反应装置：选择合适的反应装置，如发酵罐、反应釜等。

根据反应规模和条件要求，进行装置的设计和选型。

4. 反应条件控制：调节反应温度、pH值、酶浓度等反应条件，以最大限度地提高反应效率和产物纯度。

5. 反应操作：将原料添加到反应装置中，加入预先配制好的酶液，通过搅拌等方式促进反应进行。

控制反应时间和反应速率，使反应充分进行。

6. 反应结束：根据反应时间或反应物浓度的变化，确定反应结束时机。

停止反应，通过加热、调节pH值等方式使酶活性失活，停止反应过程。

7. 分离纯化：将反应产物与反应物、副产物等进行分离。

常用的分离纯化方法有过滤、离心、溶剂萃取、蒸馏等。

8. 产品收集：收集分离纯化后的果糖产物，进行检测和分析，判断产品质量和含量。

9. 后续处理：对产品进行进一步的加工和处理，如浓缩、干燥、粉碎等，以得到符合要求的最终产品。

10. 废弃物处理：对反应过程中产生的废弃物进行处理，以减少环境污染和资源浪费。

酶法生产工艺具有操作简便、生产周期短、反应条件温和等优点，广泛应用于食品工业、制药工业、化工工业等领域。

随着生物技术的不断发展，酶法生产工艺在未来将拥有更广阔的应用前景。

四、酶的提取技术1、酶提取的方法（1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。

但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。

一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。

以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。

在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。

如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。

同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。

分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。

盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。

盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。

用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。

（2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清楚。

各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。

乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。

有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。

分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。

按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。

由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。

一、实验目的1. 了解盐析的基本原理和过程。

2. 探究不同浓度的盐溶液对酶活性的影响。

3. 观察并分析盐析现象，验证酶的稳定性。

二、实验原理盐析是一种通过改变溶液中盐的浓度，使蛋白质（包括酶）从溶液中沉淀出来的方法。

盐析的原理是：当溶液中盐的浓度增加时，溶液的离子强度增大，导致蛋白质分子之间的静电斥力减弱，使蛋白质分子逐渐聚集并沉淀出来。

当盐浓度降低时，蛋白质沉淀重新溶解。

酶作为一种特殊的蛋白质，其活性受盐浓度的影响较大。

在一定范围内，随着盐浓度的增加，酶的活性会逐渐降低，当达到一定浓度时，酶活性会突然下降并发生沉淀，这种现象称为盐析。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酶溶液（如淀粉酶、蛋白酶等）- 不同浓度的NaCl溶液（0.1M、0.5M、1M、2M）- pH缓冲溶液（如pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液）- 水浴加热器- 移液器- 试管- 离心机- 移液管- 酶活性测定试剂盒（如淀粉酶活性测定试剂盒）2. 实验仪器：- 移液器- 试管- 水浴加热器- 离心机- 移液管- 酶活性测定试剂盒（如淀粉酶活性测定试剂盒）四、实验步骤1. 准备实验材料：将酶溶液、不同浓度的NaCl溶液和pH缓冲溶液分别置于试管中。

2. 设置对照组：在对照组中，加入与实验组相同体积的酶溶液和pH缓冲溶液，不加入NaCl溶液。

3. 设置实验组：在实验组中，分别加入不同浓度的NaCl溶液，使溶液的总体积保持一致。

4. 加热处理：将所有试管放入水浴加热器中，在恒定温度下加热一段时间（如30分钟）。

5. 离心分离：将加热后的溶液进行离心分离，分离出沉淀和上清液。

6. 酶活性测定：使用酶活性测定试剂盒，对沉淀和上清液中的酶活性进行测定。

7. 数据记录与处理：记录不同盐浓度下酶活性的变化，并进行统计分析。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 随着NaCl浓度的增加，酶活性逐渐降低。

- 当NaCl浓度达到一定值时，酶活性突然下降并发生沉淀。

第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。

◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。

1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。

表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。

常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。

机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。

1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。

物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。

常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。

(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。

常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。

(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。

1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。

常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。

有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。

表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。

1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。

一、实验目的1. 了解酶提纯的基本原理和方法。

2. 掌握酶的粗提纯操作步骤。

3. 观察酶提纯过程中酶活性的变化。

二、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，具有高效性、专一性等特点。

酶的提纯是指从生物材料中提取和纯化酶的过程。

本实验以唾液淀粉酶为例，采用硫酸铵盐析法进行酶的粗提纯。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：唾液、淀粉、蔗糖、硫酸铵、氯化钠、磷酸缓冲液、pH计、电炉、离心机、恒温水浴锅、显微镜、试管、烧杯、漏斗、滤纸等。

2. 试剂：1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液、5%硫酸铵溶液、1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.1mol/L氢氧化钠溶液、0.1mol/L盐酸溶液等。

四、实验步骤1. 原液制备：取一定量的唾液，加入适量的氯化钠溶液，搅拌均匀，室温下放置30分钟，以促进酶的释放。

2. 盐析：将制备好的原液加入5%硫酸铵溶液，搅拌，使蛋白质沉淀。

室温下静置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。

3. 沉淀溶解：将收集到的沉淀用磷酸缓冲液（pH 7.0）溶解，溶解过程中需不断搅拌。

4. 再次盐析：将溶解后的溶液加入5%硫酸铵溶液，搅拌，使蛋白质再次沉淀。

室温下静置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。

5. 沉淀溶解：将收集到的沉淀用磷酸缓冲液（pH 7.0）溶解，溶解过程中需不断搅拌。

6. 酶活性检测：取一定量的酶溶液，加入1%淀粉溶液，在37℃恒温水浴锅中反应10分钟，然后加入3滴碘液，观察溶液颜色变化。

五、实验结果与分析1. 酶活性检测结果显示，经过两次盐析后，酶溶液的活性明显提高，表明酶已被提纯。

2. 实验过程中，通过观察酶溶液的颜色变化，发现酶在pH 7.0时活性最高，表明该酶的最适pH为7.0。

3. 实验过程中，酶溶液的纯度不断提高，表明硫酸铵盐析法适用于酶的粗提纯。

六、实验总结1. 本实验通过硫酸铵盐析法成功提取和纯化了唾液淀粉酶，为后续酶学实验提供了纯酶。

如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。

具体操作方法如下：
取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。

继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。

将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。

以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。