抗体纯化中亲和色谱配体的研究进展

离子交换与吸附, 2005, 21(3): 283 ~ 288ION EXCHANGE AND ADSORPTION文章编号: 1001-5493 (2005)03-0283-06抗体纯化中亲和色谱配体的研究进展∗孙维敏北京交通大学理学院生物科学与技术研究所，北京 100044摘要: 亲和色谱是用于抗体纯化的有效方法，本文对亲和色谱配体的研究进展进行了综述。

关键词: 亲和色谱; 配体; 抗体; 纯化中图分类号：O647.3 文献标识码：A1 前言近年来，越来越多的抗体被用于疾病的诊断与治疗[1]，已占据生物药品市场的20%[2]。

随着生物科技的迅速发展，抗体的来源也越来越广泛[3,4]，包括天然抗体，单克隆抗体及通过基因工程方法制备的抗体。

由于抗体生产及表达系统的多样性，使得抗体的分离纯化更为复杂，这也激发了众多科研人员的研究热情。

在达到国家规定的生物药品标准的同时，力争降低生产成本。

目前，常用的分离方法可分为沉淀法、离子交换色谱法及基于亲和技术的方法，如亲和沉淀法，亲和色谱法等。

亲和色谱法近年来被用于蛋白质的纯化及蛋白质组学的研究[5,6]，是用于蛋白质分离、纯化的有效手段。

它在抗体纯化方面的应用研究也愈来愈多。

亲和色谱法是依据生物大分子能够与配体特异、可逆地结合在一起的特性，从复杂的生物样品中分离得到所需的目标产物。

它基于生物大分子与配体之间的生物学特异性，具有选择性强、纯化效率高等优点。

亲和色谱法的提纯效果取决于待纯化的物质与配体之间相互作用的专一性。

基质的种类、配体与基质之间的连接臂的种类和长度、亲和配体的选择都会影响提纯的效果。

其中，亲和配体的选择非常重要，很多研究工作都致力于配体的研究开发。

2 抗原作为配体众所周知，抗原与抗体的反应具有专一性，很多抗原也因此被用作亲和配体，用于提纯相应的抗体，在这种情况下，亲和色谱法又被称为免疫亲和色谱法。

向文斌等［7］对免疫亲和色谱在纯化核糖核蛋白SSA 抗原、SSB抗原中的应用进行了综述。

免疫亲和色谱法主要应用于从多种免疫球蛋白的混合物中，如从免疫的动物的血清中，提取某一特定的组分。

Tu等[8]用牛乳铁传递蛋白 (LF) 作为抗原免疫兔和鸡，并将抗原LF固载于溴化氰活化的琼脂糖凝胶上，制备了LF-琼脂糖色谱柱。

用此色谱柱从兔的血清中提取了IgG，鸡卵黄中提取了IgY。

结果表明，该免疫亲和色谱柱可以有效地与血清中的IgG或鸡卵黄中的IgY 结合，对IgY的吸附容量远远高于对IgG的吸附容量，前者可达到后者的17倍。

从色谱柱上洗脱时发现，* 收稿日期: 2005年2月13日项目基金: 北京交通大学人才基金资助项目(项目编号2004RC032)作者简介: 孙维敏(1971-), 女, 黑龙江省人, 博士, 讲师. E-mail:sunwm@·284·Ion Exchange and Adsorption 2005年6月IgY的解离常数大于IgG的解离常数，这表明，较之于动物血清，从鸡卵黄中更易于提取LF的抗体。

此外，用免疫亲和色谱法从鸡卵黄中提取IgY的研究报道还有很多，如外抗原为HIF－1α片段[9]、α－半乳糖[10]、TK1 C-端的合成肽段[11]等产生的抗体的纯化。

值得注意的是，亲和色谱的洗脱剂一般都是蛋白质的变性剂，洗脱时要尽快中和或除去变性剂。

免疫亲和色谱法的专一性很强，但有时抗原本身比较昂贵，或难于操作时，该方法就不适合于相应抗体的纯化。

3 蛋白质A (Protein A) 和蛋白质G (Protein G) 作为配体蛋白质A和蛋白质G是分别存在于葡萄状球菌和链球菌表面的两种蛋白质，虽然他们的氨基酸序列不同，但是都可以与免疫球蛋白的恒定区相结合，因此被用作亲和色谱的配体。

蛋白质A具有四个结合位点，其中的两个与免疫球蛋白的恒定区结合，解离常数为10-7。

另外两个结合位点与亲和色谱的基质结合，因此蛋白质A易于与载体相连。

蛋白质A稳定性较好，它在很宽的pH (2~9) 范围内保持稳定，可以耐受0.5mol/L NaOH溶液，而且在被脲及胍盐变性后，还可以重新复性，可以多次进行吸附－洗脱操作。

由于蛋白质A具有上述的诸多特点，以它作为配体的亲和色谱已用于多种免疫球蛋白的分离、纯化，包括人的单克隆或多克隆IgG，常用的实验动物如鼠、兔等的IgG。

各种不同基质的蛋白质A亲和色谱柱已经商品化。

蛋白质G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合，而且与白蛋白，α 2－巨球蛋白相结合，这使得用蛋白质G亲和色谱提纯抗体，无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。

目前，采用基因修饰的方法表达出来的蛋白质G可以克服上述缺点。

4 蛋白质A类似物作为配体虽然蛋白质A和G可以有效的分离、纯化多种抗体，但因不与IgY结合，不能用于IgY的纯化。

该配体本身是从微生物或基因修饰过的细菌中，经过复杂而昂贵的生产过程而得到，因为是生物产品，难免包含有如病毒、热原质、DNA等杂质，这会影响到抗体的药用安全性。

另外，容易被微生物降解，对有机溶剂及pH的变化敏感，使得色谱柱的使用寿命变短。

有研究已发现，在亲和分离过程中，蛋白质A 会从色谱柱上解脱下来[12,13]。

蛋白质A和G亲和色谱多用于体外分析检测中抗体的纯化，很难扩大到药品规模。

为此，人们希望能够开发出小分子物质，不仅能够像蛋白质A一样能够与免疫球蛋白相结合，而且便于制备，性能稳定。

4.1 合成肽组合化学法是一种快速制备大量相关或同类化合物的合成方法，组合肽库包括噬菌体展示肽库和合成肽库，这两类肽库均可用于小肽配基的筛选与优化。

方灿良等[14]利用正义肽与反义肽的互补作用，以流感病毒融合肽(正义肽) 的反义肽YRSKQA为模型先导结构，采用组合合成中的位置扫描法，以20种天然氨基酸为基本单元合成6肽库，共合成了6个肽库，每个肽库中含有20个肽，再通过亲和色谱对每个位置上的氨基酸进行筛选，确定6个位置的最佳氨基酸，得到针对融合肽的高亲和力多肽配基。

通过对组合肽库的筛选，人们也发现了一些合成肽可用作抗体纯化中亲和色谱的配体。

Antonio Verdoliva 等[15~17]通过筛选组合肽库，发现肽TG19318与蛋白质A性能非常相似，称为蛋第21卷第3期 离 子 交 换 与 吸 附 ·285· 图1 配体Ligand 22/8白质A 类似物，缩写为PAM ，分子式为 (Arg-Thr-Tyr)4-Lys 2-Lys-Gly 。

TG19318的分离、纯化范围更宽，不仅能够与人、兔、鼠的血清中的IgG 结合，与细胞培养上清液中鼠单克隆抗体相结合，而且可以与鸡卵黄中的IgY 相结合。

用于IgY 的纯化时，在离子强度为25mmol/L ，pH6.5的Bis-Tris 为上样缓冲液，IgY 的回收率达98.5%，纯度大于90%。

对IgY 的选择性不依赖于缓冲液的种类和 pH ，对IgY 的最大吸附容量可达64mg/ml 基质。

为改进TG19318的酶稳定性，作者用D-氨基酸代替L-氨基酸，合成的肽称为D-PAM 。

D-PAM 的抗蛋白酶水解性能明显提高，如在胰岛素或α－糜蛋白酶孵育180min ，仍保持稳定，而L-PAM 在孵育几分钟后即完全降解。

酶稳定性的提高使得D-PAM 可以在更苛刻的条件下进行抗体的提纯，使用范围更宽。

用D-PAM 亲和色谱通过一次提纯抗体的收率可以达到60%~90%，纯度高于90%。

色谱柱的容量对于人IgG 可达50mg/ml 基质，对于鼠IgG 可达52mg/ml 基质。

余晓等[18]合成了分别含有1，3及5个组氨酸的小肽，并以此寡肽作为亲和色谱的配体，研究了不同链长的寡聚组氨酸与IgG 的相互作用。

结果表明，随着配体中组氨酸残基数的增长，解离常数降低，亲和相互作用增强。

4.2 有机小分子化合物2000年，S. F. Teng [19]等通过计算机辅助设计及固相组合合成法，筛选出了化合物Ligand 22/8 (如图1)。

它与蛋白质A 的选择性相似，能够与多种不同来源的IgG 结合，如人，牛，兔，猪和鼠等，色谱柱的结合容量与蛋白质A 柱相近，对人血浆中IgG 的吸附量为51.9mg/g 基质 (湿)。

当用于从人血浆中提取IgG时，IgG 的纯度可达92.5%，一次提纯的收率为60%。

Ligand22/8色谱柱具有较好的稳定性，在1mol/LNaOH 溶液中孵育7d ，色谱柱的吸附容量未见降低。

虽然Ligand 22/8与IgG 相互作用的机理尚不十分清楚，但已经证明Ligand 22/8既与IgG 的Fc 段结合，又与Fab 段结合。

A. R. Newcombe [2]等通过筛选ProMetic 的组合配体库，发现化合物Mabsorbent®A2P 能够与IgG 结合，作者认为这是因为Mabsorbent®A2P 能够模拟蛋白质A 中氨基酸残基Phe132和Tyr133的作用，而这两个氨基酸残基在蛋白质A 与IgG 形成复合物中起重要的作用。

Mabsorbent®A2P 是一个三嗪的双取代酚衍生物，以它作为亲和配体的亲和色谱用于从绵羊的血清中提取IgG 的研究发现，与未稀释的血清中IgG 的吸附量达27mg/ml ，IgG 的纯度大于95%。

目前，琼脂糖基的Mabsorbent®A2P 色谱柱已经商品化。

5 蛋白质L 的类似物作为配体-合成有机小分子化合物蛋白质L 是从消化链球菌表面分离出的蛋白，它能够与免疫球蛋白的k1，k3，和k4轻链结合，但不与k2和λ轻链结合，可以识别50%的人类及75%的鼠免疫球蛋白。

适合于纯化免疫球蛋白的片段，如scFv, Fab, F(ab’)2。

Roque 等[20]根据蛋白质L 与免疫球蛋白Fab 段复合物的晶体结构，设计并通过组合合成的“混－分法”，合成了含有169个双取代三嗪类小分子化合物的化合物库，经过筛选发现其中某一化合物，N N N HN NH OH OH ClIon Exchange and Adsorption 2005年6月 ·286· 图2 配体Ligand 8/7称为Ligand8/7（如图2），对人IgG 和Fab 段具有很好的选择性。

以琼脂糖树脂球为固相载体，Ligand8/7为先导化合物，改变配体与固相载体基质间手臂的长度，制备了一系列亲和色谱，发现当手臂长度为6个碳原子的烷烃时，亲和色谱纯化效果最好。

实验证明，Ligand8/7不仅能够和那些与蛋白质L 相结合的免疫球蛋白很好的结合，而且还可以和不与蛋白质L 相结合的免疫球蛋白相结合，如人IgG 的λ链。

Ligand8/7还可与绵羊、牛、山羊和鸡的多克隆抗体IgG 相结合。