cdna文库的构建过程

cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。

下面将介绍CDNA文库的构建步骤。

一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。

RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。

2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。

3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。

4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。

二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。

反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。

2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。

三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。

PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。

2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。

四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。

文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。

2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。

3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。

五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。

二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。

2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。

3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。

cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。

cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。

cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。

通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。

目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。

1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。

2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。

低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。

3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。

cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。

2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。

4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。

cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (7)三．cDNA双链合成 (10)四．载体制备 (15)五. cDNA双链和载体的连接 (18)六．电转化流程 (19)七．快速鉴定、菌落PCR (22)八．pBlueScript cDNA库扩增 (25)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作:1、研钵、 5ml/10ml/ 25ml移液管、 100ml/250ml量筒、 250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部, 置于烤箱内,180℃, 烤6小时。

2、 50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后, 121℃20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常见试剂及其配方:▲DEPC水: 在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳: PH=4~5三水合柠檬酸纳 22.94g加DEPC水定容至100ml, 室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠:肌氨酸钠 10g加DEPC水定容至100ml, 室温放置备用。

▲变性裂解液:0.78M柠檬酸钠 8.25ml10%肌氨酸钠 12.375ml异硫氰酸胍 118.05g加DEPC水定容至 250ml, 室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%( v/v)▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5O 13.6gNaAc·3H2加DEPC水定容至50ml,高压灭菌, 室温放置备用▲3M醋酸钠 PH=5O 20.4gNaAc·3H2加DEPC水定容至50ml,高压灭菌, 室温放置备用▲ 4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌, 室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0, 定容到100ml, 高压灭菌, 室温放置备用▲10X MOPS (3-( N-吗啉代) 丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3HO 4.10g20.5MEDTA( PH 8.0) 20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L, 室温避光放置备用。

cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。

CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。

从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。

cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA 第一链的合成：poly(A)+RNA(1μg/μl)10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)1μl1mol/LTris-HCl(pH8.0,37℃) 2.5μl1mol/LKCl 3.5μl250mmol/LMgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1mol/LDTT2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。

在这个小规模反应管中加入0.1μl[α-32P]dCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。

3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。

4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。

大规模反应管则在70℃温育10min，然后转移至冰上。

5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。

此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。

CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。

cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。

本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。

二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。

1.准备细胞样本或组织样本。

2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。

3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。

4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。

2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。

1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。

2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。

3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。

4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。

5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。

2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。

2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。

2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。

3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。

2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。

2.确定酶切产物的大小和酶切位点。

2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。

2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。

3.控制反应条件，如温度和时间。