光合细菌及其在水产养殖中应用研究进展

收稿日期:2005-08-02作者简介:林春友,1964年生,男,天津蓟县人,副研究员,主要从事水生动物病害防治工作。光合细菌及其在水产养殖中应用研究进展

林春友(天津市水产研究所　300221)

摘要:光合细菌菌体内含有细菌叶绿素a、b、c、d、e、g和多种类胡萝卜素,根据营养方式可分为光能自养菌和光能异养菌,繁殖方式主要为二等分裂,少数属或种为芽殖,营养非常丰富,蛋白质质量分数高达65%,氨基酸组成齐全。PSB对水环境有净化功能,在水产养殖中应用的主要种类是红螺菌科菌种。PSB中鱼虾必需脂肪酸含量不足,作为仔鱼虾初期饵料时,应与其它富含高度不饱和脂肪酸的饵料配合使用;对细菌病、真菌病有较好的防治效果。关键词:光合细菌;水产养殖;应用;研究进展中图分类号:S96312,S94213 文献标识码:A 文章编号:1003-1278(2005)06-0025-04 光合细菌(Photosyntheticbacteria,PSB)是具有原始光能合成体系的原核生物的总称,是水环境中重要的微生物类群,具有净化水质、维持水环境微生态平衡、预防和治疗水生动物疾病等功能;其营养体富含蛋白质、维生素及促进生物生长的生物活性物质,是水产养殖动物优质的饲料添加剂。近年来,随着应用研究的不断深入,光合细菌在水产养殖方面的作用越来越受到人们的重视。1　PSB的分类地位依据1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版),PSB分为2类,即蓝色细菌门(蓝藻门)和细菌门真细菌纲红螺菌目;又依据Truperpferning的意见,将光合作用中不产氧的红螺菌目分为红螺菌科、着色菌科、绿菌科和绿丝菌科。其中在生产上有意义的为红螺菌科,包括红螺菌属、红假单胞菌属、红微菌属。2　PSB的基本特征及繁殖方式2.1　形态特征PSB有球形、卵圆形、杆状、环形、半环形、螺旋状等形状。大部分单个存在,仅有红微菌属等少数菌体细胞间有丝状连结。有些菌种的细胞形态易随培养条件和细胞生长阶段的不同而发生变化。红螺菌科细胞大小为0.6～0.7μm×1～10μm,着色菌科为1～3μm×2～5μm,绿菌科为0.7～1μm×1～2μm。PSB菌体内含有色素,可将其分为细菌叶绿素a、b、c、d、e、g和多种类胡萝卜素。不同种PSB因其所含色素种类和数量存在差异而显示不同的菌体颜色,如紫色、红色、桔黄色、棕黄色、绿色。2.2　营养方式根据营养方式,PSB可分为光能自养菌和光能异养菌。光能自养菌能利用光能将简单的无机物合成自身生长和繁殖所需要的复杂有机物,在光合作用中主要以H2S为供氢体,以CO2为碳源,不能利用有机物,如着色菌科和绿菌科种类。光能异养菌能利用光能将外界有机物转化为自身能利用的有机物,在光合作用中以有机物为供氢体,以有机物或CO2为碳源,如红螺菌科种类。光能自养菌属于绝对厌气性细菌,仅在缺氧条件下进行不放氧的光合作用,在含氧丰富的水域中无法生存,在缺乏光线时也无法生存。光能异养菌既能在有光无氧的条件下进行光合作用,也能在黑暗有氧条件下靠分解有机物生存,即在有光无氧或有氧无光的条件下均能生存,只是在有氧无光条件下才不能进行光合作用。2.3　繁殖方式PSB繁殖方式主要为二等分裂,少数属或种为芽殖。3　PSB对水环境的净化功能光能异养菌在自身繁殖过程中能利用小分子有机物做碳源、供氢体,利用水环境溶解氮(如铵、硝酸盐、亚硝酸盐等)做氮源合成有机氮化物,因此可消耗水中的小分子有机物、铵、硝酸盐、亚硝酸盐,起净化水质的作用。而光能自养菌没有分解有机物的能力,又属于绝对厌气性细菌,通常无法在有氧环境中生长,因此在水环境净化过程中其重要性不如光能异养菌。光能异养菌不能利用水环境中的大分子有机物,水体中的大分子有机物(如蛋白质、脂肪、糖)必须先由一般异养菌(如枯草杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、硫化菌等)分解成小分子有机物(如氨基酸、低级脂肪酸、小分子糖等)后才能被光能异养菌分解利用,因此在利用PSB净化水质时应配合使用一般异养菌。4　PSB的营养功能PSB的营养非常丰富,蛋白质质量分数高达65%(表1),氨基酸组成齐全(表2),且含有各种B族维生素、类胡萝卜素、辅酶Q、叶酸、生物素(表3)、矿物质等生理活性

物质[1]。这些生理活性物质在生物新陈代谢过程中起着重要作用。如VB12、叶酸、生物素和辅酶Q在蛋白质、氨基酸代谢中作为辅酶起重要作用;VB6构成转氨酶、氨基酸脱羧酶、半胱氨酸脱硫酶辅酶等参与蛋白质代谢;叶酸转为四氢叶酸时,参与机体内一碳基团的转移,与蛋白・52・2005年第25卷第6期 水　利　渔　业 (总第142期)质、氨基酸的合成有关;叶酸还与造血及血红蛋白的形成有关;PSB中的生物素为d-异构体,具有较活泼的生理活性,而人工合成的生物素均属L-型,无生理活性;PSB含有大量的泛醌(辅酶Q),每1g菌体(干重)含10mg,泛醌是一种与生命有重大关系的生理活性物质。表1　PSB菌体营养成分%光合菌蛋白质粗脂肪可溶性糖粗纤维灰分紫色非硫菌65.457.1820.312.784.28表2　PSB的氨基酸组成%氨基酸紫色非硫菌氨基酸紫色非硫菌赖氨酸4.3～5.1组氨酸1.8精氨酸4.5～5.5天门冬氨酸9.7～11.1苏氨酸6.6～7.4丝氨酸5.2～5.5谷氨酸10.7～12.8脯氨酸5.2～5.5苯丙氨酸3.9～4.5甘氨酸9.0～10.1丙氨酸11.0～13.1胱氨酸0.4缬氨酸6.2～6.8甲硫氨酸0.8～2.8异亮氨酸3.7～4.7亮氨酸8.5～8.8酪氨酸2.4～2.9色氨酸++表3　PSBB族维生素的组成μg/g种类VB1VB2VB6VB12烟酸泛酸叶酸生物素组成12505211253060655　PSB在水产养殖中应用的主要种类目前,PSB在水产养殖中应用的主要种类是红螺菌科菌种,常用的有3～5种。这些种类在有机物存在时,以有机物为供氢体,在有机物缺乏时,也能以H2S为供氢体。它们在有氧或无氧的水域中均能生存,对环境的适应能力较强。其中沼泽红假单胞菌净化水质的效果较理想;球形红假单胞菌细胞个体较大,生长迅速,适于做饲料添加剂;而荚膜红假单胞菌防病作用较强[2]。6　红螺菌科PSB的培养6.1　培养基在培养基的碳源、氮源、矿物质及生长因子中,以酵母浸膏促生长作用最明显。PSB对碳源的利用以葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、甘露糖醇、烟酸、酒石酸较好,而乙酸钠来源广、价格便宜;对氮源的利用以氯化铵最好,硫酸铵次之。乙酸钠、氯化铵、硫酸锰、硫酸亚铁、氯化钴的最适添加量分别为1.75g/L、0.75g/L、25.6mg/L、25mg/L、2.75mg/L[3]。基础培养基:NH4Cl0.75g,NaHCO31g,K2HPO40.5g,CH3COONa1.75g,MgCl20.4g,NaCl12g,酵母膏0.1g,加蒸馏水1000mL。pH为7.0～7.5,113℃,高压灭菌30min。培养海水光合菌用天然海水或人工海水配制培养基,培养基中的磷酸盐宜用KH2PO4。6.2　培养条件光照强度为2000～5000lx,波长800～900nm,温度为20～34℃,最适温度25～30℃,pH为7.0～7.5。6.3　PSB在生产上的培养方法6.3.1　三级培养法　一级培养采用试管或玻璃瓶,采用高压灭菌培养基,无菌条件下接种,接种量10%～20%。二级培养采用5000～20000mL玻璃瓶,培养基须煮沸消毒,冷却到25℃左右接种,接种量10%～20%。三级培养采用50L透明塑料桶,培养液用次氯酸钠消毒12～24h,再用硫代硫酸钠还原后再接种,接种量20%～30%[4]。6.3.2　大棚简易富集培养法　大棚内建造2000～5000L的水池,水池内铺上塑料膜,向水池中加入培养液,将PSB原液按2%的体积浓度加到培养液中,搅拌均匀后覆膜厌氧培养。可用40W白炽灯照射,光照强度在2000lx以上,培养温度30～37℃,10～15d可获得体积密度5×106/mL的棕红色菌液[5]。6.3.3　应用型扩大培养液培养法　在天然水体中添加6g/L的醋酸钠和0.1g/L的酵母膏,灭菌后作为扩大培养液,其培养效果与基础培养液相近[6]。此法为施入养殖水体内PSB的快速增殖提供了依据。7　PSB菌种及成品的保存张李阳等[7]介绍了光合细菌的几种保存方法并对保存方法进行了评价。液体培养法培养的PSB保存时间较短,一般2～3个月须转接1次以保存活力,此法易操作,成本低,但菌种易贴壁,且易受污染,适用于小规模生产应用PSB的单位进行保种。半固体保种法、固体保种法是利用穿刺法进行保种,保种时间一般在6个月左右。半固体保种法PSB生长更好一点,活菌数要多一些,2种方法操作简单,染菌率低于液体保种法,但总体保菌量偏低。冷冻干燥法保种时间较长,一般在10年以上,干燥物体积小生物量大,且不易被污染,但该方法操作较复杂,成本较高,适于试验条件较好的研究机构和科研院校进行PSB保种。常仁亮等[8]报道将球形红假单胞菌增殖培养,浓缩后形成的糊状PSB(生物量1.5%～2.

0%)经过储存,比液体PSB产品表现出更具有耐储藏性,色泽、菌体均匀度、无污染等特征明显,经2年密闭常温储藏其复活性能及技术指标稳定(比活率>95%),不影响其使用价值。许进香等[3]报道,PSB浓缩后细菌密度超过50亿/mL,可久放而不被霉菌污染。李勤生[9]报道,用液体培养基培养的红螺菌属、红假单胞菌属PSB产品(菌体密度为109/mL),在室温光照条件下保存半年后用于养殖试验,效果良好;在40℃黑暗条件下存放15d,大部分细胞仍可存活,细菌量略有下降,而室温保存的细菌量略有增加。8　PSB在水产养殖中的应用8.1　养殖水体净化剂许多学者对PSB净化水的效果进行了研究报道。王梦亮等[10]利用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和类球红细菌(Rhodopseudomonassphaeroides)纯培养物1∶1的混合物(pH7.5,活菌数1.6×109/mL),按30kg/hm2用量一次性洒入鱼塘,待PSB大量增殖并趋于稳定时,试验池水质比对照组有明显改善,其中溶解氧增加68%,COD下降21%,氨氮下降58.7%,硝酸氮下・62・(总第142期) 水　利　渔　业 2005年第25卷第6期降29.4%,硫化物下降77.4%。邱宏瑞等[11]向水族箱内的养鱼试验用水中加入荚膜红假单胞菌,水体细菌密度为1.04×106～2.0×106/mL,24h氨氮、亚硝酸盐分别下降35%～41%和70%～81%。施安辉等[12]分别用沼泽红假单胞菌、绿色红假单胞菌、胶质红假单胞菌、球形红假单胞菌(菌密度均在30亿/mL以上)在室内净化污水,使用质量浓度10mg/L,10d后测定,COD分别下降了9.89%、2.85%、9.34%、11.51%;氨氮分别下降了34.51%、13.33%、28.97%、18.37%;亚硝酸盐下降了29.27%、13.19%、30.34%、16.25%。黄美珍等[13]在虾池中全池泼洒5～10mg/L的光合细菌(菌密度为22亿～26亿/mL),每隔10～15d使用1次,养殖早期每日清晨试验池的溶解氧比对照池高,均在4mg/L以上;养殖中后期试验池每日6时和8时溶解氧比对照组高12.5%和18%。朱励华等[4]报道,以PSB15kg/hm2拌砂洒于虾池,能有效改善虾池底质环境。郑耀通等[14]用游离、固定化2种形式的光合细菌(1株类球红细菌和2株红细菌属光合菌混合培养)分别净化模拟养殖水体,75L水中一次性加入固定化光合菌100g(含水率约80%),游离菌用量与固定化光合菌用量相同,第15天开始,固定化细菌组氨氮下降了98.9%,游离化细菌组氨氮下降了88.8%,而自然条件下只下降了68.1%;COD自然去除率33.7%,游离化细菌组COD去除率上升到44.6%,固定化细菌组COD去除率上升到70.6%;溶解氧在自然状态下增加到18.3%,游离细菌组溶解氧增加41.2%,固定化细菌组溶解氧增加63.4%。综上所述,使用PSB能有效降低养殖水体COD,降低水体NH4+、NO-2、H2S等有害物质的浓度,增加水体溶氧量,从而改善了水环境,可降低养殖动物发病率,促进动物生长。由于使用PSB的种类、形式、浓度以及水质具体状况不同,其净水效果存在差异。PSB净化水质时,其泼洒用量为5～15mg/L(含菌量3亿～4亿/mL),用法是将PSB与20倍的水混合后全池泼洒;也可将PSB与沙土搅拌均匀后洒于池底,投饵区与重度污染区可增加使用量和使用次数[2,4]。8.2　饵料生物PSB作饵料生物的效果有许多研究报道。张永红等[15]向培育草鱼夏花的池塘投喂PSB(红螺菌科细菌),第1天剂量为10mg/L,第2～27天剂量为1mg/L,投喂方法是将PSB拌于豆浆中在池塘中均匀泼洒,试验池比对照池成活率提高27.5%,提高产量360kg/hm2。王育锋等[16]用PSB菌液(含球形红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、胶质红假单胞菌,菌密度21.2亿/mL)培养鲢、鳙、草鱼、鲂鱼大规格鱼种,每1kg饲料喷拌菌液6mL投喂,并先后2次向养殖池中泼洒4mg/LPSB菌液,经过3个多月的饲养,鱼种成活率较对照池提高了27.8%,增产183.85kg/hm2,饲料系数降低0.13,每1kg鱼种生产成本降低6.96%。史家梁报道[1],向孵化后10～50d的真子鲽鱼苗池中泼洒PSB,所用PSB为5g/L的菌液,每天给0.6mg/L,与真子鲽活饵(轮虫等)一起投喂,80d共投入48mg/L,鲽鱼平均体长比对照组增加24%,平均体质量增加46%。原永党等[17]利用几株PSB混合液作为海湾扇贝幼体及稚贝培育期水质净化剂及辅助饵料育苗生产试验,浮游幼体生长速度提高了18.3%,浮游期成活率提高了20.3%,幼体提前30h出现眼点,稚贝变态率提高14.5%,产量提高94%。崔竞进等[18]利用几株光合细菌混合液作中国对虾育苗期辅助饵料,在无节幼体投放前和蚤状幼体Ⅱ期向50m3试验水体中分2次投放PSB,使水体含菌量4000/mL,发育至蚤状幼体时,虾苗普遍比对照组胃肠饱满,且托便率较多;由蚤状幼体(Z3)后的第4天转变成糠虾Ⅰ期时,试验池的变态率比对照池提高了3倍,且幼体挂脏率低50%;由糠虾(M)发育至仔虾(P)时,试验池仔虾数比对照池多1倍,多出虾苗近百万尾,且个体大,均匀,健壮。乔振国等[19]利用沼泽红假单胞菌(含干菌2～4g/L)投喂东方对虾,饲料菌液添加量12L/kg,经过40d的室内饲养,试验组体质量比对照组增加16.2%。黄美珍等[13]用光合菌喂养长毛对虾,试验池对虾成活率比对照池高23.0%,饵料效率比对照池高15.7%,平均产量3150kg/hm2,比对照池增产121%。张道南等[20]利用经沼泽红假单胞菌强化投喂的枝角类投喂孵化后的金鱼苗,15d后,鱼苗平均体质量比对照组增加了44.4%;用沼泽红假单胞菌菌液投喂0.1m3水体内的脊尾白虾蚤状Ⅱ期幼体,每天投喂140mL(含干菌2g/L),经19d培养,虾苗幼体变态率为94.1%,成活率63.7%,而对照组变态率77%,成活率44.4%。作为辅助饵料,PSB起补充营养、改善代谢机能、提高饵料转化率的作用,因此,用PSB作鱼虾贝类幼体开口饵料时,大大提高了幼体成活率;将PSB菌体加入饵料有效提高了饲料效率。PSB用于鱼虾幼体开口饵料时,其用量通常为50～100mg/L,分早、晚2次泼洒投喂;PSB做饲料添加剂时,用量通常为质量分数0.2%～2%,将菌液稀释后均匀喷洒在配合饲料或鲜活饲料上即可投喂[2,4]。由于PSB中鱼虾必需脂肪酸含量不足,因此作为仔鱼虾初期饵料时,应注意与其它富含高度不饱和脂肪酸的饵料配合使用[21]。8.3　预防和治疗疾病施入水环境中的PSB大量繁殖时能分泌抗生素,可抑制病原菌的繁殖;荚膜红假单胞菌细胞壁中含有的多糖类为非特异性免疫激活剂,水生动物摄食后可增强免疫力和抗病力,从而减少疾病的发生。邱宏瑞等报道[22],耐盐红螺菌的代谢产物对弧菌属、气单胞菌属和假单胞菌属水生动物致病菌有抑制作用,其平板抑菌直径为1.2～1.4cm,最低抑菌浓度多为4～8倍稀释液。赵亮等报道[23],向人工半咸水河蟹全封闭育苗系统中投放PSB20g/m3,每隔5d投喂1次,弧菌数量下降了11.1%,气单胞菌下降了8.3%,硝化细菌数量提高了5倍。孙建军等报道[24],利用光合菌喂平均体长7.5cm的中国对虾,投喂量占饵料质量的0.5%,经22d,试验组虾体酚氧化酶(PO)、超氧化歧化酶(SOD)、溶菌活力和抗菌活力分别比对照组高102.2%、22.1%、53.4%和14.0%,血细胞数目高67.2%。史家梁报道[1],日本曾有人将20尾发生“穿・72・2005年第25卷第6期 水　利　渔　业 (总第142期)