还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione,GSH)含量测定试剂盒使用说明

GSH 的测定方法1．样品0.3g 用 2ml 6% (w/w) 的偏磷酸冰浴研磨，12000 g离心15-20 分钟2．GSH+GSSG的测定：取上清液0.4 ml 然后加入0.6 ml (0.5M pH 7.5) 的磷酸缓冲液稀释，然后加20ul 的蒸馏水，用于测总的谷胱苷肽。

但本实验没有稀释因为稀释后测的值太低就直接取100 ul 的上清液测定的。

3．GSSG的测定：取上清液0.4 ml 然后加入0.6 ml （0.5 M , pH 7.5）的磷酸缓冲液稀释，然后加入40 ul 的2-乙烯基吡啶，在25 °下反应1小时，用于测定GSSG。

但本实验没有稀释就是因为稀释后测定的值太低就直接取500 ul 的上清液直接加入30-40ul 的 2-乙烯基吡啶，在25°下反应1小时。

注意：建议先稀释一个试一下，看能否测出值，然后决定是否稀释。

4. 反应体系：1600 ul 100 mM pH 7.5 PBS100 ul 0.6 mM DTNB (5,5 –二硫代双－2－硝基苯甲酸)100 ul 提取液100 ul 0.2 mM NADPH100 ul 3个单位的GR5. 在412 nm 反应1分钟。

6. 药品的配制：1） 100 ml 6%(pH 2.8, 1mM 的EDTA) 的偏磷酸： 6 g 偏磷酸加热溶于水后，加入0.02925 g EDTA(EDTA 可能不溶要事先配一个母液) 然后调pH 到2.8 最后定容到100 ml .2) 100 ml 0.5M pH 7.5 的PBS的配制：先把0.5 M 的A液及0.5 M 的B 液配好，然后取16ml A+ 84ml B, 最后用HCL调 pH 到7.5。

3）200 ml 100 mM pH 7.5 的PBS：16 ml 0.2 M A+84ml 0.2 B, 稀释到200 ml.4) 0.6 mM DTNB: DTNB 用100 mM pH 7.5 的PBS 来配制，好溶。

主要目的：——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。

主要原理：参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG），由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。

用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章一、试剂——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）二、仪器设备—— 96 孔酶标板—— UV-Vis 可见多功能酶标仪——旋涡混匀器——离心机——移液枪及其相应量程枪头三、实验方法根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。

2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂二、试剂三、 mL 试剂四。

3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。

4.血清中 GSH含量计算公式GSH含量（ mg/L）测定 OD值 -空白 OD值-3 mmol/L）×标准品浓度（ 20×10标准 OD值-空白 OD值×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数组织中 GSH含量公式测定OD值-空白OD值-3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L）×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度（gprot/L ）参考文献Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.。

小鼠还原型谷胱甘肽(GSH)快速检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E11897m检测范围：0.8 ng /ml -200ng /ml特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的GSH，且与其他相关蛋白基本无交叉反应。

有效期：6个月（2-8℃避光保存）预期应用：ELISA法定量测定小鼠血清，血浆及其它相关生物液体中GSH含量。

说明1.浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

2.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理采用竞争酶联免疫法法检测GSH含量。

首先用一株单抗体包被微孔板，制备成固相抗体，然后加入待测标本及辣根过氧化物酶标记的另一株单抗，使之形成包被抗体-GSH-酶标记抗体的复合物。

经显色后在酶标仪测定吸光值（OD 值），通过计算机或作图拟合浓度-吸光度曲线，反算出待测标本中GSH含量。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：5瓶（冻干品）。

标准品为冻干品，使用前分别用0.5ml蒸馏水溶解，溶解后浓度分别为：3.酶结合物（HRP-conjugated antibody）：1×6ml/瓶。

4.显色剂A（Substrate A）：1×7ml/瓶。

5.显色剂B（Substrate B）：1×7ml/瓶。

6.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。

7.终止液（Stop Solution）：1×7ml/瓶需要而未提供的试剂和器材1.标准规格酶标仪2.高速离心机3.电热恒温培养箱4.干净的试管和Eppendof管5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

HPLC 法测定莲子中还原型谷胱甘肽（GSH ）和总巯基（-SH ）含量魏斌，李鹏，崔胜云*（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉133002）摘要：利用5，5'-二硫双-2-硝基苯甲酸（DTNB ）为衍生化试剂，采用细胞破壁、衍生化为一体的同步衍生化提取、HPLC 法测定了莲子中GSH 和总巯基（-SH ）含量。

本文对样品前处理过程和色谱流动相的选择分别进行了优化，有效的阻止了前处理过程中巯基氧化变性对测定灵敏度降低而导致的漏检及消除了衍生化产物3，5-硝基-3-巯基-苯甲酸（NTB ）色谱峰拖尾所造成的干扰，并借此选择性测定了莲子中GSH 和总巯基（-SH ）含量。

结果表明；三次测定莲子中GSH 和总巯基（-SH ）含量均值分别为0.9711μmol/g 和1.3686μmol/g ，方法的回收率分别为101.02%和100.09%，检测限分别为4.21μmol/L 和4.63μmol/L 。

关键词：莲子；高效液相色谱法；谷胱甘肽；巯基化合物；5，5，-二硫双-2-硝基苯甲酸Dertermination of Reduced Glutathione （GSH ）and Total Thiols in Lotus Seeds by High PerformanceLiquid Chromatography （HPLC ）WEI Bin ，LI Peng ，CUI Sheng-yun *（Key Laboratory of Natural Resources &Functional Molecules of Changbai Mountain of Ministry of Education ，Yanbian University ，Yanji 133002，Jilin ，China ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Reduced glutathione （GSH ）and total thiols in Lotus Seed were determined by HPLC assay utilizing 5，5'-dithio-bis （2-nitrobenzoic acid ）（DTNB ，Ellman's reagent ）as the derivatizing agent with concomitant cell rupture during the sample pretreatment.Sample pretreatment and elution solutions were optimized in order to inhibit reduced sensitivity and serious tag of chromatographic signal for derivatized product 2-nitroso -5-thiol-benzoic acid （NTB ），and selectively determined GSH and total thiols （-SH ）in Lotus Seed.The results showed that the average amount of GSH and total thiols in Lotus Seed were 0.9711μmol/g and 1.3686μmol/g ，the average recoveries of the methods were 101.02%and 100.09%，detection limits were 4.21μmol/L and 4.63μmol/L respectively.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Lotus seed ；HPLC ；GSH ；thiol compounds ；DTNB基金项目：国家自然科学基金项目（21165021）作者简介：魏斌（1989—），男（汉），硕士研究生，从事植物活性成分测定研究。

南瓜籽中还原型谷胱甘肽(GSH)和蛋白巯基(P-SH)的测定应译娴;邱岳;张小勇;崔胜云【摘要】The contents of reduced glutathione (GSH) and protein thiols (P-SH) in pumpkin seed were detected by pre-column derivatization HPLC method using 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB) as derivatizing agent with concomitant cell rupture sample pretreatments.The results showed that detected pumpkin seed contained relatively abundant GSH and thiols in P-SH.The amounts detected were:GSH=1.045 μmol/g,thiols in P-SH=1.887 3 μmol/g respectively.The recoveries of the methods are99.55 ％-100.49 ％,and detection limits are 0.138 4 μmol/g for GSH and0.218 4 μmol/g for protein thiols.The results provided a useful data for the application of pumpkin seed for the healthcare.%用5,5-二硫双-2-硝基苯甲酸(5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid,DTNB)为柱前衍生化试剂,采用细胞破壁、衍生化为一体的同步衍生化提取,HPLC梯度洗脱测定市售南瓜籽干品中还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和含半胱氨酸残基的含巯基蛋白(Thiol protein,P-SH)的巯基含量.结果发现南瓜籽含较丰富的GSH和P-SH的巯基,其3次测定均值分别为GSH含量为1.045 μmol/g,P-SH的巯基含量为1.8873μmol/g.在优化的选定条件下,该测定方法的回收率为99.55 ％～100.49％,GSH和P-SH巯基测定检测限分别为0.138 4 μmol/g和0.2184 μmol/g.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)015【总页数】5页(P143-147)【关键词】高效液相色谱法;南瓜籽;谷胱甘肽;巯基蛋白质【作者】应译娴;邱岳;张小勇;崔胜云【作者单位】延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002【正文语种】中文南瓜是葫芦科南瓜属草本植物的果实，是在我国各地都有广泛种植的味美可口的瓜菜。

谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。

它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。

谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。

因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。

3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。

五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。

2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。

3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-24 00:00 来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG 参照Anderson等（1992）。

取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ，pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。

总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20，40 mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15 mmol•L-1EDTA，0.3 mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）DTNB，0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA，50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、400 μL反应液3（5% Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。

测定OD412下的吸收值。

GSSG 含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。

GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。

GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。

取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。

一、实验目的了解植物组织中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

二、实验原理谷胱甘肽（GSH）是一种具有抗氧化作用的天然三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。

在生物体内，谷胱甘肽具有多种生理功能，如保护细胞免受氧化损伤、参与药物和毒素的解毒过程等。

还原型谷胱甘肽含量的测定对于研究生物体内氧化还原平衡、疾病诊断和药物治疗具有重要意义。

本实验采用分光光度计法测定植物组织中还原型谷胱甘肽的含量。

该方法的原理是：在一定的pH条件下，还原型谷胱甘肽与5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长处有最大吸收峰。

通过测定该波长处的吸光度值，可以计算出还原型谷胱甘肽的含量。

三、实验材料与仪器1. 材料：小麦幼嫩叶片、5,5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇等。

2. 仪器：分光光度计、电子天平、离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器等。

四、实验方法与步骤1. 样品制备：取小麦幼嫩叶片，用无水乙醇研磨成匀浆，离心取上清液。

2. 标准曲线绘制：分别取6支干净的试管，按表1加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，以DTNB浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

3. 样品测定：取6支干净的试管，按表2加入试剂，反应20分钟后，于423nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算还原型谷胱甘肽的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0048x-0.0031，相关系数R²=0.9967。

2. 样品测定：根据标准曲线计算小麦幼嫩叶片中还原型谷胱甘肽的含量为（X±SD）mg/g。

六、讨论1. 实验结果表明，小麦幼嫩叶片中含有一定量的还原型谷胱甘肽，其含量与样品制备方法和实验条件有关。

GST（谷胱甘肽转硫酶）测定原理：GST（谷胱甘肽转硫酶）测定具有催化还原性谷胱甘肽GSH与2，4 二硝基苯CDNB 结合的能力，其结合产物的光吸收峰值波长为340nm,通过测定340nm处吸光度上升速率，即可计算出GST的活力单位。

反应式为：C6H3(NO2)2Cl+GSH→C6H3(NO2)2SG+H++Cl-实验仪器：分光光度计实验试剂：1）0.1mol/l 磷酸盐缓冲液PH 6.5（配制见p331）2) 10m mol/l 还原型谷胱甘肽(GSH)：用前临时配制，15.35mg GSH 溶于少量磷酸盐缓冲液，定容于5.0ml3) 1.25 mmol/l CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)：称取25.35mg，溶于5.0ml无水乙醇，加磷酸盐缓冲液定容至100ml，室温下可用一周实验步骤：取样品，精确称量后（约取0.05g）,加1.5mlPBS冰上研磨，离心，收集上清酶活测定反应体系（参照孟师兄）试剂总反应（ml）非酶反应(ml)GSH(10m mol/l) 0.05 0.05CDNB(1.25 mmol/l) 0.4 0.4PBS(0.1mol/l) 0.45 0.55样品液0.1 ------混匀后测定0，1，2，3，4，5min处340nm的吸光值(初步估计要做6个样，每个样做3个平行。

药品消耗大概：GSH 1.8ml, CDNB 24.4ml PBS 18ml)GST蛋白浓度测定（1）标准曲线绘制试管：0 1 2 3 4 5 61mg/ml标准蛋白溶液：0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 双蒸水; 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04向各管分别加入3ml的考马斯亮蓝，测OD595（595nm为GST染色后的特征吸收峰）结果计算：1) 计算酶反应的A340值：为总反应测定所得的（A340）总与非酶反应的（A340）非之差，即（A340）酶=（A340）总—（A340）非2）根据不同时间测定的（A340）酶，计算酶促反应每分钟的平均变化值△（A340）/min 3) 样品中酶的比活力按下式计算：GST(U/mg)=△A/minⅹ(106 V总/(ε d V样))= △A/minⅹ（106/(9.6ⅹ103ⅹ1)）ⅹ(3/0.1)= △A/minⅹ3125ε:产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6ⅹ103M-1cm-1106:摩尔分子换算成非摩尔分子d:比色皿光径（cm）V总：测定总体积（ml）V样：所用样品体积（ml）以下因素可导致误差：1 CDNB在水中溶解度较低，在测定体系中仅达到亚饱和水平2 随时间的延长，逐渐失去良好的线性关系Notes：DTNB溶解度很小，PH对溶解非常重要。

GSH含量测定一、原理还原性谷胱甘肽(GSH)是植物细胞重要的抗氧化剂之一，是一个良好的表示氧化胁迫的指标。

GSH+TDBN在pH=7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。

即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。

由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

二、材料、试剂、仪器1、材料：小麦叶片2、试剂(1）GSH标准溶液：称取10mg 分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容于10ml，即为1mg/ml 之标准母液，用稀释10倍（0.1mg/ml GSH）；(2）5%偏磷酸；(3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；(4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；(5）1mol/L NaOH溶液。

2、仪器（1）可见分光光度计：4台；（2）离心机：1台（10000转/分）；（3）1/千天平-2台；（4）离心管：3支×16（10ml）（5）刻度试管：4×16支；（10或15ml）（6）普通试管（刻度试管）：7支×4（15*150 标准曲线）（7）刻度吸管：0.5ml-8支； 1ml-8支; 2ml-16支; 5ml-8支；（8）研钵：1×16个；（9）比色杯4套；（10）吸水纸适量；（11）剪刀8把；（12）玻棒8支；三、方法步骤：1、制作标准曲线：取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。

在412nm波长下测定吸光度。

以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。

）2 、样品测定：称取植物鲜样0.204g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。

10000rpm 离心10min。

离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。

（本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断！）Elabscience®还原型谷胱甘肽(GSH)比色法测试盒Reduced Glutathione (GSH) Colorimetric Assay Kit产品货号：E-BC-K030-S产品规格：50 assays(48 samples)/100 assays(96 samples)检测仪器：紫外-可见光分光光度计（420 nm）使用前请仔细阅读说明书。

如果有任何问题，请通过以下方式联系我们：销售部电话************，************技术部电话131****6790具体保质期请见试剂盒外包装标签。

请在保质期内使用试剂盒。

联系时请提供产品批号(见试剂盒标签)，以便我们更高效地为您服务。

用途本试剂盒适用于检测血清、血浆、动植物组织样本及培养细胞中GSH的含量。

检测原理还原型谷胱甘肽（GSH）可与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应产生硫代硝基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（反应式见下图），硝基巯基苯甲酸是一种黄色化合物，在420 nm处，可进行比色定量测定还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。

本试剂盒检测组织和细胞样本时，需测定总蛋白浓度，推荐使用考马斯亮蓝法（货号：E-BC-K168-S）提供试剂和物品说明：试剂严格按上表中的保存条件保存，不同测试盒中的试剂不能混用。

对于体积较少的试剂，使用前请先离心，以免量取不到足够量的试剂。

所需自备物品仪器：紫外-可见光分光光度计（420 nm）、涡旋混匀仪、磁力搅拌器、微量移液器（1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL）、烧杯（250 mL）耗材：枪头（1000 μL，200 μL，10 μL ）、EP管（5 mL、2mL）、吸水纸、擦镜纸、磁力搅拌子试剂：双蒸水或去离子水、生理盐水（0.9% NaCl）或PBS（0.01 M，pH 7.4）。

试剂准备①检测前，试剂盒中的试剂平衡至室温。

还原型谷胱甘肽检测标准
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种重要的细胞内抗氧化剂，它能够清除自由基，保护细胞免受氧化应激的损伤。

谷胱甘肽检测是衡量体内谷胱甘肽水平的一种方法，可以评估体内抗氧化能力和氧化应激状态。

还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是谷胱甘肽的活性形式，其浓度的改变反映了细胞内氧化还原平衡的变化。

还原型谷胱甘肽检测标准是指确定衡量还原型谷胱甘肽浓度的实验方法和结果解读的参考范围。

常见的还原型谷胱甘肽检测方法包括高效液相色谱法（HPLC）、光度法、流式细胞术和电化学法等。

在进行谷胱
甘肽检测时，可以根据实验方法的要求，采集样本、提取还原型谷胱甘肽、加入标准品进行定量测量，并根据标准品的浓度范围进行结果解读。

通常情况下，人体血液中还原型谷胱甘肽的标准浓度范围是
2-20 μM。

这个范围是通过大量的临床研究得出的，可以用作
评估人体抗氧化能力和氧化应激状态的参考。

需要注意的是，不同实验室可能会使用不同的标准浓度范围或检测方法进行谷胱甘肽检测。

因此，在具体的实验室中进行检测时，应该参考该实验室所使用的标准范围和方法进行结果解读。

同时，还应该综合考虑个体差异以及其他临床指标，来评估谷胱甘肽水平的意义和临床价值。

还原型谷胱甘肽（GSH）检测
谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，含有巯基的三肽，广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用，如抗氧化作用、整合解毒作用。

谷胱甘肽在体内以还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）两种形式存在，其活性成分为还原型谷胱甘肽，可参与体内三羧酸循环，激活各种酶，对不稳定的眼晶状体蛋白质巯基有抑制作用，从而抑制白内障的发展，抑制角膜及视网膜病变，在角膜损害时能促进上皮组织的修复。

迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)法，可高效、精准的检测还原型谷胱甘肽的含量变化。

此外，我们还提供其他氨基酸及其代谢物检测服务，以满足您的不同需求。

HPLC和LC-MS测定还原型谷胱甘肽样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 还原型谷胱甘肽含量信息。

一、实验目的1. 了解谷胱甘肽在生物体内的作用和重要性。

2. 掌握谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

3. 通过实验，提高实验室操作技能和数据分析能力。

二、实验原理谷胱甘肽（GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的天然三肽，具有强大的抗氧化作用。

在生物体内，谷胱甘肽参与多种生物化学反应，包括抗氧化、解毒、细胞信号传导等。

本实验采用比色法测定植物组织中谷胱甘肽的含量。

比色法测定谷胱甘肽含量的原理如下：1. 在一定条件下，还原型谷胱甘肽（GSH）与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）反应，生成黄色的2-硝基5-巯基苯甲酸（TNB）。

2. 通过测定TNB在特定波长下的吸光度，可以计算出样品中谷胱甘肽的含量。

三、实验材料与仪器1. 材料：植物组织（如芦笋、花椰菜等）、DTNB溶液、EDTA-Na2溶液、Na2HPO4溶液、NaH2PO4溶液、蒸馏水等。

2. 仪器：可见光分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器等。

四、实验步骤1. 样品制备：取一定量的植物组织，加入适量的蒸馏水，用匀浆器充分匀浆，制成匀浆液。

在低温高速离心机中以3000 r/min离心10分钟，取上清液作为待测样品。

2. 标准曲线绘制：分别配制不同浓度的GSH标准溶液，按照实验方法测定其吸光度。

以GSH浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：取一定量的待测样品，按照实验方法测定其吸光度。

根据标准曲线，计算出样品中谷胱甘肽的含量。

4. 数据处理：将实验数据输入计算机，进行统计分析，得出实验结果。

五、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.046x + 0.0058，相关系数R2 = 0.9986。

2. 样品测定：取一定量的芦笋匀浆液，按照实验方法测定其吸光度，计算得到谷胱甘肽含量为0.023 mg/g。

3. 数据分析：通过实验结果可以看出，植物组织中谷胱甘肽含量较高，说明植物具有较好的抗氧化能力。

还原型谷胱甘肽（Glutathione Reduced,GSH）含量测定试剂盒使用说明货号:BC1170常量法（50T/48S）一、试剂盒组成：试剂Ⅰ液体1瓶50ml（4℃保存）试剂Ⅱ液体1瓶50ml（4℃保存）试剂Ⅲ液体1瓶15ml（4℃避光保存）标准品粉末1支10mg（4℃避光保存）说明书一份二、实验原理谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。

谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。

2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。

因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

三、实验仪器分析天平、微量匀浆器（规格2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、1ml比色皿。

四、操作步骤1、样品的处理组织处理新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。

加入用试剂Ⅰ润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml试剂Ⅰ（组织/试剂Ⅰ比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000rpm4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

血液处理血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂Ⅰ,4℃，8000g离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS 清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积试剂Ⅰ，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

南瓜籽中还原型谷胱甘肽（GSH ）和蛋白巯基（P-SH ）的测定应译娴，邱岳，张小勇，崔胜云*（延边大学理学院化学系，吉林延吉133002）摘要：用5，5-二硫双-2-硝基苯甲酸（5，5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid ，DTNB ）为柱前衍生化试剂，采用细胞破壁、衍生化为一体的同步衍生化提取，HPLC 梯度洗脱测定市售南瓜籽干品中还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione ，GSH ）和含半胱氨酸残基的含巯基蛋白（Thiol protein ，P-SH ）的巯基含量。

结果发现南瓜籽含较丰富的GSH 和P-SH 的巯基，其3次测定均值分别为GSH 含量为1.045μmol/g ，P-SH 的巯基含量为1.8873μmol/g 。

在优化的选定条件下，该测定方法的回收率为99.55%～100.49%，GSH 和P-SH 巯基测定检测限分别为0.1384μmol/g 和0.2184μmol/g 。

关键词：高效液相色谱法；南瓜籽；谷胱甘肽；巯基蛋白质Dertermination of Reduced Glutathione （GSH ）and Thiols in Proteins （P-SH ）in Pumpkin SeedYING Yi-xian ，QIU Yue ，ZHANG Xiao-yong ，CUI Sheng-yun *（Chemistry Department ，College of Science of Yanbian University ，Yanji 133002，Jilin ，China ）Abstract ：The contents of reduced glutathione （GSH ）and protein thiols （P-SH ）in pumpkin seed were detect －ed by pre-column derivatization HPLC method using 5，5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid （DTNB ）as derivatiz －ing agent with concomitant cell rupture sample pretreatments.The results showed that detected pumpkin seed contained relatively abundant GSH and thiols in P-SH.The amounts detected were ：GSH=1.045μmol/g ，thiols in P-SH=1.8873μmol/g respectively.The recoveries of the methods are 99.55%-100.49%，and detection limits are 0.1384μmol/g for GSH and 0.2184μmol/g for protein thiols.The results provided a useful data for the application of pumpkin seed for the healthcare.Key words ：high performance liquid chromatography （HPLC ）；pumpkin seed ；glutathione ；thiol proteins食品研究与开发F ood Research And Development2017年8月第38卷第15期DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.029基金项目：国家自然科学基金项目（21165021）作者简介：应译娴（1992—），女（汉），硕士研究生，从事植物活性成分测定研究。