实验项目：荧光分光光度法测定维生素B2的含量
【实验题目】
荧光分光光度法测定维生素B2的含量
【实验目的】
1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
【实验原理】
维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为：
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此
它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有
机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳
定。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿
色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH＝6~7的
溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液
浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的
含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而
转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的
物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F＝2.303ФI0εbc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc
这是荧光光语法定量分析的依据。
【主要仪器与试剂】
主要仪器：F-2500 HiTachi荧光分光光度计；1cm石英皿；50mL容量瓶；5mL移液管；烧杯；胶头滴管
试剂：维生素B2标准溶液：未知液4
【实验内容及步骤】
1、系列标准溶液的制备
取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。标记为①②③④⑤的一系列维生素B2标准溶液。待测。
2、待测液制备
取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度，摇匀。待测。3、激发光谱和荧光发射光谱的绘制
设置λem＝540nm为发射波长，在250~500nm范围内扫描标准溶液③，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图上找出其最大激发波长λex。在此激发波长下，在400~600nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长λem。
4、标准溶液及样品的荧光测定
将激发波长固定在最大激发波长λex，荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处λem。扫描蒸馏水和上述5个标准液的荧光发射强度。数据记录于表1中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。
在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓
度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。
【数据记录与结果分析】
①、维生素B2激发光谱图：
最大激发波长λex=373nm
②、维生素B2荧光发射光谱图：
最大荧光发射波长处λem=524nm
③表1：标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度数据记录：
维生素B2溶液浓度/（μg/mL）0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 相对荧光强度0.234 24.65 48.00 70.50 91.86 112.9
④、系列标准溶液浓度与荧光发射强度的标准曲线图：
由计算机处理得标准曲线方程为y=112.49x-1.7769
相关系数r=
则待测溶液的浓度c =0.907μg/mL
【问题讨论】
1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？
答：原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。
2、维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。
