产纤维素酶真菌的筛选与鉴定
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产纤维素酶真菌的筛选与鉴定
史同瑞;刘宇;王岩;王爽;李丹;陈曦;秦平伟
【摘 要】为从秸秆中分离出能够降解纤维的菌株,试验采取秸秆样品接种马铃薯琼脂培养基,在室温环境下培养,取分离菌接种纤维素刚果红琼脂培养基,筛选能形成较大降解圈的细菌,并进行形态学和分子生物学鉴定,测定其纤维素酶性质.结果表明,经分子生物学鉴定,筛选菌为黑曲霉菌,该菌在室温环境能够生长,菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为7.64.筛选菌在20℃环境下培养5d酶活达到最高值,为42.18 U/mL.纤维素酶最适pH为7.0,最适反应温度为20℃,在20～40℃或pH
6.0～8.0环境下作用1h,相对酶活力仍保持在90％以上.综上所述,本试验分离的黑曲霉菌株是低温产纤维素酶菌株,产酶能力较强,具有潜在的开发价值.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)010
【总页数】6页(P2794-2799)
【关键词】秸秆降解;黑曲霉;纤维素酶
【作 者】史同瑞;刘宇;王岩;王爽;李丹;陈曦;秦平伟
【作者单位】黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006
【正文语种】中 文 【中图分类】TQ925
植物秸秆是自然界中最为丰富的有机物资源，据统计，2010年中国仅农作物秸秆产量就达8.4亿t［1］。植物秸秆干重的33.4%～50.0%是植物纤维，植物纤维是工农业生产可利用的重要再生资源，然而由于受植物纤维利用技术的限制，植物秸秆尚未得到充分有效的利用［2］。每年产生的大量植物秸秆或是被废弃在自然环境中，或是被焚烧处理，这不仅严重污染自然环境，且还造成资源的浪费。应用纤维素酶降解植物纤维是利用植物秸秆的有效途径之一，因此植物秸秆生物降解技术已成为近年来研究的热点。
在降解植物纤维的微生物中，普通产纤维素酶微生物的最适作用温度为45～65℃，而低温产纤维素酶的最适作用温度可降至20 ℃［3］。由于低温产纤维素酶微生物可在低温环境中生长，且在产业化应用中能节约能源和费用，因此，研究开发低温产纤维素酶微生物具有广阔的应用前景。黑龙江省秸秆资源丰富，环境温度偏低，开发低温产纤维素酶微生物更具切实意义。目前，文献报道的低温产纤维素酶微生物大多是从若尔盖高寒湿地等高寒地区和海洋中分离的，且产纤维素酶微生物的种类主要是细菌和放线菌，有关真菌的报道较少［4］。为分离适应黑龙江气候条件的产纤维素酶微生物，本试验从本地植物秸秆中分离出1株产纤维素酶真菌，并对所产纤维素酶的性质进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒（SK8229）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Fungi Identification PCR Kit（RR178）、6×Loading
Buffer（RO11－11）、DL2000 DNA Marker（3427A）均购自宝生物工程（大连）有限公司。 1.1.2 培养基 马铃薯琼脂培养基（PDA）：葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，土豆浸液1L，pH 自然。液体产酶发酵培养基：蛋白胨1g，CMC－Na 5g，NH4NO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO41g，蒸馏水1L。刚果红培养基1：纤维素2g，明胶2g，刚 果 红0.2 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.5 g，（NH4）2SO42g，NaCl
0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH 自然。刚果红培养基2：葡萄糖5g，纤维素2g，明胶2g，刚果红0.2g，K2HPO41g，MgSO40.5g，（NH4）2SO42g，NaCl
0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH 自然。刚果红培养基3：葡萄糖5g，纤维素2g，明胶2g，刚果红0.4g，K2HPO41g，MgSO40.5g，（NH4）2SO42g，NaCl
0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH 自然。刚果红培养基4：纤维素5g，刚果红0.2g，K2HPO41g，MgSO40.5g，NaNO33g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH自然。
1.2 方法
1.2.1 产纤维素酶菌株筛选 取玉米秸秆样品，用无菌水冲洗后置于无菌三角瓶中，加适量无菌水，浸泡12h后弃去无菌水，室温放置。在观察有真菌生长时，采取真菌样品接种PDA 培养基，置25℃环境培养48～72h。取单菌落接种PDA 培养基，置25 ℃环境培养24～48h，然后取单个菌落点种刚果红培养基1，室温环境培养，观察真菌生长情况，筛选能形成较大降解圈的真菌。取筛选菌点种4种配方刚果红培养基，比较降解圈形成时间、大小及清晰度，测量筛选菌降解圈直径（H）与菌落直径（C）的比值（H／C），并初步判定筛选菌降解纤维素的能力［5－6］。
1.2.2 形态特征观察 取筛选菌点种PDA 培养基，室温培养，观察菌落形态、颜色等变化。用透明胶带黏取真菌菌落，然后从一侧轻轻黏在滴有美蓝染色液的载玻片上，排出空气，避免产生气泡，观察真菌菌丝大小、形态、表面特征及孢子大小、形状及类型等。 1.2.3 分子生物学鉴定 参照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒操作方法，提取分离真菌菌株的基因组DNA。参照Fungi Identification PCR Kit体系与操作方法进行PCR 反应，分别扩增未知真菌的ITS全序列和26SrDNA D1／D2区域。ITS全序列上 游 引 物P1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，下游引物P2：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，预扩增片段长度为500～750bp；26SrDNA D1／D2 区 域 上 游 引 物P1：5′－GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG－3′，下游引物P2：5′－GGTCCGTGTTTCAAGACGG－3′，预期扩增片段长度为600bp左 右。PCR 反
应 体 系50 μL：模 板DNA 1μL，PCR Premix 25μL，上、下游引物（P1／P2）各0.5μL，ddH2O 23μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5min；94 ℃变性1min，50 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析仪观察结果，PCR 产物送至英潍捷基上海贸易有限公司测序。使用BLAST 方法将测序结果与GenBank数据库中已知菌序列进行同源性分析。
1.2.4 纤维素酶学性质测定
1.2.4.1 酶活力测定 参照文献［4］方法测定酶活力。取筛选菌接种液体产酶发酵培养基，置20℃180r／min振荡培养，在培养2、3、4、5、6和7d时取培养液，6 000r／min离心15min，收集上清即为粗酶液。取0.5%羧甲基纤维素钠1 mL，加入0.1mol pH 7.0的磷酸缓冲液4mL，蒸馏水1mL，粗酶液1mL，于40℃水浴中反应15min，取出加入DNS试剂5mL，沸水浴中煮沸3min，置冷水中冷却。测D450nm值，依据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量，求得酶活力［3］。试验同时设蒸馏水为对照组，每组设3个平行。
酶活力单位定义：在上述条件下，每毫升酶液在1min内催化底物生成1μmol葡萄糖所需要的酶量，即1U／mL。纤维素酶活力计算公式为： X=（5.56×M×n）／V×t
式中，X，纤维素酶活力（U／mL）；M，吸光度在标准曲线上计算的葡萄糖量（mg）；n，酶液稀释倍数；V，酶液体积（mL）；t，时间（min）；5.56为1
mg葡萄糖的μmol数（1 000／180=5.56）。
1.2.4.2 热稳定性测定 将粗酶液分别置于20、30、40、50、60、70、80 ℃环境下作用1h，并以未进行处理的粗酶液作为对照，每组设3个平行，测定相对酶活力。纤维素酶稳定性以存余酶活力与对照酶活力的百分率表示。
1.2.4.3 酸碱稳定性测定 用pH 分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液分别配制含1.0%粗酶溶液，室温作用1h后，以用蒸馏水配制的1.0%粗酶溶液作为对照，每组设3个平行，测定相对酶活力，计算存余酶活力的百分率。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选结果
样品接种PDA 培养基共分离出5株菌，菌株纯化后点种纤维素刚果红培养基1，确定有1株真菌具有较强产纤维素酶能力，且该菌株在室温和20℃环境培养均可生长。真菌点种4种刚果红培养基，在刚果红培养基1培养24h，即可形成较大的清晰降解圈。在刚果红培养基2和刚果红培养基3真菌培养24h虽然也可形成降解圈，但相对较小，透明度也不清晰，培养至48～72h时才可形成较清晰的降解圈。在刚果红培养基4，筛选菌虽生长不良，但降解圈非常小。真菌在刚果红培养基1形成的降解圈直径为27.5mm，菌落直径为3.6mm，菌株H／C为7.64（图1），据此判断该菌株降解纤维能力较强。
图1 菌株在刚果红培养基1上形成的纤维素水解圈Fig.1 Cellulose hydrolysis
circle of the strains on the cellulose－congo red medium 1
2.2 菌株形态特征 筛选真菌在PDA 培养基生长较快，培养24h形成中央隆起、外周绒毛状的白色菌落（图2A）；培养48h形成中央褐黑色、有放射状皱褶、外周白色绒毛状的圆形平展菌落（图2B）；培养72h菌落更大（图2C）。镜检观察分生孢子呈褐黑色，球形，边缘呈放射状排列的圆柱体，分生孢子梗呈褐色，双层，光滑（图3）。
图2 不同培养时间菌株菌落形态Fig.2 Colony morphology of the strains at
different culture time
图3 菌株显微形态特征（400×）Fig.3 Micromorphology of the strains（400×）
2.3 分子生物学鉴定结果
由图4可知，分离真菌菌株经PCR 扩增，均在约600bp处出现特异性扩增条带，与预期结果相符。BLAST 分析结果显示，分离真菌菌株与Gen－Bank上登录的黑曲霉菌91718 菌株（登录号：JN565296）ITS区域基因同源性为99.5%，与黑曲霉菌IFM54309菌株（登录号：AB363747）26SrDNA D1／D2区域基因同源性为100%，表明所分离的真菌菌株为黑曲霉菌。
图4 目的基因PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification of target geneM，DL2000 DNA Marker；1，ITS 全 序 列PCR 产 物；2，26SrDNA D1／D2区域PCR 产 物；3，阳 性 对 照；4，阴 性对照M，DL2000DNA Marker；1，PCR
