黄瓜绿斑驳花叶病毒病危害西瓜抽样技术初探

利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒作者：肖璐李玲唐炎英戴思慧王军辉刘泽发孙小武来源：《长江蔬菜·学术版》2013年第01期摘要：以疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的西瓜植株上收取的种子为材料，提取总RNA为模板进行RT-PCR扩增，并对电泳后的目标条带进行回收测序，将测序结果提交genebank与已知序列比较，结果显示所扩增序列为CGMMV 外壳蛋白（CP）基因中的一个片段，说明此方法可以成功检测出西瓜种子携带的CGMMV，可作为一种快速检测西瓜种子是否携带CGMMV的方法。

关键词：西瓜种子；黄瓜绿斑驳花叶病毒；RT-PCR中国是世界西甜瓜第一生产大国，西甜瓜播种面积每年约230万hm2，主产区遍布全国20多个省、自治区、直辖市[1]。

并且自20世纪80年代中期以来，西甜瓜生产一直是我国许多地方农民经济收入增加的重要来源。

CGMMV是烟草花叶病毒属葫芦科植物的重要病毒之一，对葫芦科作物生产造成严重威胁[2～5]。

2006年我国农业部（农业部公告第788号）已将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。

由于种子带毒是CGMMV传播的主要途径，而种子是农业生产中不可替代的生产资料。

因此，加强西甜瓜种子的安全生产，建立健全种子病毒检测方法，杜绝带毒劣质种子上市，从源头控制CGMMV的扩散蔓延有重要意义。

CGMMV的检测方法有多种且均较为成熟，各有各的优点，但以西瓜种子为检测材料还未见报道。

本研究以从感染CGMMV的西瓜植株上采集的种子为试验材料，并应用优化的RT-PCR 进行检测鉴定，最终能够扩增出与目标片段大小一致的条带，将目标条带进行回收测序，测序结果显示扩增出的片段是CGMMV外壳蛋白（CP）基因的一段序列。

本试验为种子生产企业在CGMMV的诊断与快速检测提供了参考。

1 材料与方法1.1 材料的获得于2012年6月在山东发现疑似感染CGMMV的西瓜植株，待果实成熟后采集该植株果实并取种用于CGMMV的检测。

黄瓜绿斑驳花叶病毒病危害西瓜特点及防治技术黄瓜绿斑驳花叶病毒是葫芦科植物的重要病毒，是我国植物检疫性病害。

温岭市于2011年突发，发病面积达100.7 hm2。

笔者为了探索黄瓜绿斑驳花叶病毒病危害西瓜的特点和防控技术，进行了田间调查研究。

1发生特点1.1种子带菌情况据2011年中国检科院植检所鉴定结果，嫁接西瓜的发病主要以砧木（蒲瓜）种子带菌。

其2010年8—12月生产的不同西瓜的种子送检样品19个，全部为阴性；砧木种子18个，其中阳性为9个，品种分别为京欣砧王、京欣砧冠、京欣砧一号、神通力、韩砧一号、甬砧一号、威力砧二号等。

1.2品种抗病性西瓜对黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性差。

2011年田间叶片抽样送检，天山牌、好利得等品牌早佳84-24等18个品种，全部为阳性。

但田间发病有差异，小兰株发病率为16.7%，早佳84-24为44.3%。

1.3危害特点西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒病在幼苗和成株期都可发病[1-2]。

但幼苗期及移栽前期由于气温低，田间症状表现不明显。

塑料大棚和小拱棚栽培从4月中下旬，露地栽培从5月下旬至6月上旬开始发病，且随着田间气温的上升和西瓜生育期的推进，发病日益趋重。

据2011年7月田间普查，西瓜株发病率5%～100%，平均42.2%。

西瓜早期受侵染后，植株生长缓慢，出现不规则的褪色或淡黄色花叶，绿色部位凸出表面，叶面凹凸不平，叶缘上卷，叶片略微变细，其后出现浓绿凹凸斑，病蔓生长停滞并萎蔫，随叶片老化，症状减轻；危害严重时，呈黄绿色花叶症状，叶面凹凸不平，叶片明显硬化[3]。

田间调查结果表明，嫁接西瓜以砧木种子带菌发病为主；对黄瓜绿斑花叶病毒病抗性差。

在幼苗期及移栽前期由于气温偏低，田间症状表现不明显。

1.4产量损失西瓜果实感染黄瓜绿斑驳花叶病毒病后，种子周围的果肉变紫红色或暗红色水渍状，成熟时变为暗褐色并出现空洞，呈丝瓜瓤状，俗称“血果肉”。

严重时，变色部位软化溶解，呈脱落状，味苦不能食用，失去经济价值。

西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病遗传分析与抗性基因定位研究西瓜(Citrulluslanatus)是葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属中的栽培种,重要经济作物之一,属于世界十大水果之列。

随我国农业产业结构的调整和优化,西瓜的种植面积和产量已居世界首位。

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染西瓜主要病毒病之一,是典型的种传病害,近几年田间发病较严重。

西瓜植株受到CGMMV病毒侵染后会出现花叶、畸形叶、植物生长受阻、果实瓤色变紫等症状,导致产量降低和商品品质下降,严重时甚至绝产。

本研究以抗CGMMV的野生西瓜种质’PI595203’和高感的栽培种’M1511-3’为亲本获得的F2遗传分离群体,分析了 CGMMV抗性遗传规律,利用基于全基因重测序的BSA方法初步定位了西瓜抗CGMMV的候选基因。

主要结果如下:1)野生西瓜种质’PI595203’和栽培种’M1511-3’的抗性鉴定经机械摩擦接种CGMMV,通过调查’PI595203’和’M1511-3’病情指数、病毒基因的表达和ELISA检测分析,结果表明’P1595203’对CGMMV表现为抗性,’M1511-3’对CGMMV表现为高感。

2)西瓜抗CGMMV基因的遗传分析以西瓜抗、感自交系’PI595203’和’M1511-3’为亲本,构建F2群体。

对Fi(30株)、F2(320株)群体进行CGMMV机械摩擦接种鉴定抗性,Fi群体植株表现为感病,F2群体表型出现性状分离且呈正态连续分布,结果表明西瓜CGMMV抗性为数量性状,由多对隐性基因控制。

3)西瓜抗CGMMV基因定位选取F2群体中感抗样品构建感病池和抗病池,并对其进行重测序。

关联分析获得了 1个与抗病性状相关1.01Mb的候选区域,对该区域进行功能注释,共获得56个编码基因。

黄瓜绿斑驳花叶病毒的危害症状和传播途径
1 危害症状
1.1 西瓜感染病毒症状
在植株的幼叶出现不规则的褪绿色或淡黄色，呈斑驳花叶状，使绿色部分隆起叶面凸凹不平，叶缘向上翻卷，叶片略变窄细。

叶片老化后症状逐渐不明显，与健叶无大区别。

病果表面出现浓绿色略圆的斑纹，有时在中央出现坏死斑。

果梗现褐色坏死斑。

果肉周边接近果皮部呈黄色水渍状，进而种子周围的果肉变紫红色或暗红色水渍状，果肉内出现块状黄色纤维，逐渐成为空洞。

成熟果果肉全变成暗红色，内有大量空洞呈丝瓜瓤状，软化，腐烂变味，不能食用。

1.2 甜瓜感染病毒症状
生长初期接种后7d～10d，顶部第3片～4片幼叶出现黄色斑或花叶，远看顶部附近呈黄色，以后展开的3片～4片叶症状反而减轻，再后的3片～4片叶又出现黄花叶，不断变化。

成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。

果实有两类症状，一种在幼果再现绿色花叶，肥大后期呈绿色斑。

另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。

1.3 黄瓜感染病毒症状
开始在新叶出现黄色小斑点，以后黄色部分扩展成花
叶，并发生浓绿瘤状突起，有时黄色小斑点沿叶脉扩展成星状，或脉间褪色出现叶脉绿带。

果实在病轻时只发生淡黄色圆形小斑点，病重时出现浓绿色瘤状突起变成畸形，严重时可以造成绝产。

2 传播途径
该病毒通过多种方式传播，包括种子、嫁接、农事操作、植物间接触、汁液、花粉、病残体及含病株残体的土壤、栽培营养液、灌溉水、被污染的包装容器等。

其中带毒种子是远距离传播主要途径，接触性传染是近距离传播主要途径，嫁接是最易传播的途径。

黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子鉴定及检测技术研究的开题报告一、研究背景及意义黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus, CGMMV）是一种单股正链RNA病毒，是黄瓜生产中的重要病害之一。

该病毒病害主要表现为黄瓜叶片出现绿色的斑驳和驳花症状，导致黄瓜叶片凋萎和产量降低。

CGMMV属于Potyviridae科，具有高度的致病性和传染性，能够通过种子、土壤、工具等途径传播，给黄瓜生产带来严重危害。

目前，CGMMV的危害已经成为全球范围内的问题，病毒扩散的速度很快，对黄瓜的生产和社会经济带来了很大的损失。

因此，开展CGMMV的分子鉴定及检测技术研究，对病害的有效防治和控制具有重要意义。

基于分子鉴定和检测技术，能够快速准确地检测出病毒，为黄瓜生产提供可靠的技术支持和依据。

二、研究内容和方案本研究主要以CGMMV分子鉴定和检测技术为研究对象，具体研究内容和方案如下：1. 分子鉴定技术的开发：采用RT-PCR技术对CGMMV的基因组序列进行分析，确定适合鉴定的靶标序列。

设计特异性引物，建立CGMMV 的RT-PCR检测方法，并进行验证和优化。

2. 分子检测技术的建立：基于LAMP技术，设计适合的引物组合，建立CGMMV的LAMP检测方法，并比较LAMP与RT-PCR的检测效果。

3. 分子鉴定和检测技术的应用：利用已建立的鉴定和检测方法对实际黄瓜病样进行检测，验证方法的可靠性和准确性，并为CGMMV的防治提供技术支持和参考。

三、研究进度和计划本研究已经完成了CGMMV基因组序列的分析，并初步确定了RT-PCR的引物方案。

下一步计划是对引物进行优化，并对RT-PCR法进行验证和比较。

同时，也将开始LAMP检测方法的设计和优化，以便比较两种检测方法的优缺点。

最终计划在6个月内完成所有实验，并进行分析和评估。

四、结论和意义本研究的开展将为黄瓜生产中CGMMV的防治提供技术支持和参考。