6分子生物学基本研究法(下)
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分子生物学研究
分子生物学研究引言分子生物学是现代生物学的一个重要分支，主要关注生物体内的分子机制。
通过研究核酸、蛋白质等大分子的结构和功能，科学家们能够揭示生命的奥秘。
本文将简要介绍分子生物学的研究内容、方法以及一些重要的研究成果。
研究内容1. 核酸研究核酸包括DNA和RNA，是遗传信息的载体。
分子生物学的重要任务之一就是研究核酸的结构与功能。
例如，DNA双螺旋结构的发现为理解遗传信息的存储和传递奠定了基础。
此外，RNA在基因表达调控中的作用也是研究的重点之一。
2. 蛋白质研究蛋白质是生命活动的主要执行者。
分子生物学研究蛋白质的合成、折叠、功能及其与其他分子的相互作用。
通过了解蛋白质的功能，可以更好地理解细胞的生理过程。
3. 酶学研究酶是一类具有催化作用的蛋白质，能加速生物化学反应。
分子生物学研究酶的结构、催化机制及应用，如在医药和工业上的应用。
4. 信号传导研究细胞通过复杂的信号传导网络进行通信。
分子生物学研究这些信号通路的组成、调控及功能，以揭示细胞间的信息交流机制。
研究方法1. 分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学的基本工具，用于获取、扩增和改造特定基因。
常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）和质粒构建。
2. 基因编辑技术CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，使科学家能够精确地修改基因序列，从而研究基因的功能和治疗遗传疾病。
3. 高通量测序技术高通量测序技术（如NGS）能够快速测定大量DNA或RNA序列，极大地推动了基因组学和转录组学的发展。
4. 结构生物学方法X射线晶体学、核磁共振（NMR）和冷冻电镜（Cryo-EM）等技术用于解析蛋白质和其他生物大分子的三维结构，为理解其功能提供重要信息。
重要研究成果1. DNA双螺旋结构的发现沃森和克里克于1953年提出DNA双螺旋结构模型，这一发现奠定了现代分子生物学的基础。
2. RNA世界假说RNA世界假说认为早期生命形式主要以RNA为基础，RNA既是遗传物质又具有催化功能，为理解生命起源提供了新的视角。
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
RNA核酸酶RNA诱导的沉默复合体
RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性 （如地高辛、生物素等）标记的特异性探针 与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在 与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双 链RNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫 显色，对该基 因的表达产物做出定性定量 分析。
用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因 的表达
2、条件型基因敲除：
完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由 于具有可调节性而受到科学家的重视。
特点：常将正向选择标记neor置于内含子中。
6. 2. 2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括： 构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中。 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中并得以表达。 主要实验流程及筛选步骤：
分离提取合成cDNA
用锚定酶AE消化
分3ˊ端酶切两份，分
别与ⅡS类TE标签酶
识别位点结合。
标签酶TE酶切
末端补平
连接两份，根据接头1、 2设计引物进行PCR
得到双标签，分 离纯化串联入载体。
常规SAGE 方法（short SAGE）基本 流程
连接子1和连 接子2的5ˊ 端分别加有 氨基，以防 止5ˊ端相 连接。
同的ⅡS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修
改。
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术
RRT-NPAC的R：选把择R性N剪A提接取是后指反用转不录同成的c剪DN接A方，式并从以一其个为 模m板R进NA行前的体PC中R产反生应不。同的mRNA剪接异构体的过程。
可分为： •平衡剪切； •5’选择性剪切； •3’选择性剪切； •外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
第九章分子生物学研究方法下自测题
第九章分子生物学研究方法下自测题单选题）可用来检测选择性剪接的方法是A. RT-PCRB. NEST-PCRC. AP-PCRD. TAIL-PCR2.（单选题）不属于基因组编辑技术的是A. ZFNB. VIGSC. TALEND. CRISPR/Cas3.（单选题）荧光共振能量转移（FRET）实验中常用的探针不包括A. 荧光蛋白B. 青色染料Cy3C. 生物素D. 荧光素4.（单选题）真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在哪种氨基酸残基A. Ser，Tyr和ThrB. Met，Pro和ThrC. Ser，Cys和TrpD. Asp，Glu和Trp5.（单选题）在植物转化的双元载体系统中，外源基因位于A. 与vir基因相同的质粒上B. 任意一个质粒C. 两个质粒都有D. 与选择性标记基因相同的质粒上6.（单选题）关于RNAi，下列说法正确的是A. 在哺乳动物细胞内，用较长的dsRNA会引发非特异性基因沉默B. 非哺乳动物细胞利用较长的双链RNA合成siRNA，最后引发RNAiC. 植物细胞利用较长的双链RNA直接诱导产生RNAi，无须合成siRNAD. RISC复合体可切割靶mRNA中与siRNA正义链互补的区域7.（单选题）酵母双杂交体系用于A. 哺乳动物功能基因的表型分析B. 研究功能基因的亚细胞定位C. 检测细胞核内发生互作的蛋白质D. 研究RNA聚合酶对转录的激活作用8.（多选题）转录组测序的方法包括A. SAGE技术B. Edman降解法C. EST技术D. Long SAGE技术9.（多选题）RNA的选择性剪接包括哪几种类型A. 内含子保留B. 5'选择性剪接和3'选择性剪接C. 外显子遗漏型剪接D. 相互排斥性剪接10.（多选题）Ti质粒上除了介导DNA转移的T-DNA片段外，还有A. 致毒Vir（virulence region）基因B. 植物生长素和分裂素合成基因C. 乙酰丁香酮合成基因D. 冠瘿碱合成基因11.（多选题）凝胶滞缓实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）可以用来研究A. DNA与蛋白质相互作用B. RNA与蛋白质相互作用C. 蛋白质与蛋白质相互作用D. DNA与RNA相互作用12.（多选题）应用RNA原位杂交可显示A. 细胞内特定的mRNAB. 蛋白质的降解速率C. 基因在染色体上的定位D. 基因的转录活性13.（多选题）荧光共振能量转移（FRET）现象发生需满足的基本条件是A. 给体与受体在1～10nm的距离B. 给体的发射光谱与受体的吸收光谱没有重叠C. 给体的发射光谱与受体的发射光谱有部分重叠D. 给体与受体的偶极具有一定的空间取向14.（多选题）关于噬菌体的叙述正确的是A. 脱离宿主细胞后不能生长和复制B. 溶原周期噬菌体称为温和噬菌体，溶菌周期噬菌体称为烈性噬菌体C. 溶原周期噬菌体感染过程中可产生大量的子代噬菌体D. 溶菌周期噬菌体DNA可整合到宿主染色体DNA上，感染过程中不产生子代噬菌体15.（判断题）反向遗传学是从表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术一、引言分子生物学是研究生物体的分子结构、功能和相互关系的学科。
分子生物学基本技术是指在分子水平上进行研究的实验技术和方法。
本文将介绍几种常用的分子生物学基本技术。
二、聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应是一种用于扩增DNA片段的技术。
它可以从少量DNA样本中扩增出大量的目标DNA片段。
PCR的原理是通过不断重复DNA的变性、引物结合和DNA合成的过程，使目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR广泛应用于基因克隆、基因检测、遗传学研究等领域。
三、DNA电泳DNA电泳是一种通过电场作用使DNA分子在凝胶中迁移的技术。
DNA的迁移速度与其分子大小成反比，因此可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
在DNA电泳中，DNA样品首先经过限制性内切酶切割，然后在凝胶电泳中进行分离。
最后，通过染色剂染色，可观察到DNA片段的分离结果。
四、基因克隆基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体等。
基因克隆技术可以用于基因的定位、表达和功能研究。
克隆的基本步骤包括DNA片段的切割、载体与DNA片段的连接、转化等。
五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
常用的表达系统包括原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如哺乳动物细胞）。
表达蛋白质的基本步骤包括构建表达载体、转化表达宿主细胞、诱导表达、蛋白质纯化等。
六、核酸杂交核酸杂交是一种通过DNA或RNA的互补碱基配对形成双链结构的技术。
核酸杂交可用于检测目标DNA或RNA的存在、定位和表达水平。
常用的核酸杂交技术包括Southern blotting、Northern blotting和in situ杂交等。
七、蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用是细胞内发生的重要生物学过程。
研究蛋白质相互作用可以揭示蛋白质的功能和信号转导机制。
常用的蛋白质相互作用研究技术包括酵母双杂交、共免疫沉淀、荧光共振能量转移等。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法分子生物学是生命科学领域中的重要分支，研究生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的结构、功能及其在生物体内的相互作用关系。
分子生物学的研究方法随着技术的不断进步，越来越高效、精准。
本文将介绍几种常见的分子生物学研究方法。
1. PCR技术PCR技术是分子生物学中最常用的研究方法之一。
PCR技术简单来说就是以DNA为模板，通过循环加热和降温的方式使DNA 分离成两条单链，并利用DNA聚合酶合成新的DNA分子。
通过PCR技术可以扩增目标DNA片段，为其他分子生物学研究提供了重要的基础。
PCR技术的具体操作是：首先选择适当的引物，引物是一段长度为15~30个核苷酸的单链DNA，与目标DNA上的两端互补，可用来定向扩增DNA。
然后将待扩增的DNA样品与引物混合，加入适当浓度的DNA聚合酶和反应缓冲液，反复加热降温，反应若干个周期后，就可以得到扩增的DNA产物。
近年来，PCR技术不断发展，出现了许多高级变体，如RT-PCR技术和qPCR技术等。
这些技术在分子生物学、医学以及疾病诊断等领域得到了越来越广泛的应用。
2. 质谱技术质谱技术是一种分析化学技术，用于测定化合物的分子量、化学式以及数量等信息。
在分子生物学中，质谱技术主要用于分析蛋白质和核酸的结构和功能。
质谱技术的基本原理是将待测样品中的分析物（如蛋白质、核酸等）转化成气态或溶液状态下的离子，并利用质谱仪测定离子的质荷比。
通过离子的质谷比可以确定分析物的分子量、化学式以及数量等信息。
质谱技术的应用范围非常广泛，包括蛋白质组学、代谢组学以及疾病诊断等领域。
随着技术的不断进步，质谱技术也变得更加高效、精准，未来将有更多的应用。
3. 基因编辑技术基因编辑技术近年来获得了长足发展，它可以通过将基因序列中的单个碱基替换、插入或删除，来打造定制化的基因组序列。
这种技术有巨大的应用潜力，可以用于人类基因疾病的治疗以及植物、动物品种改良等领域。
基因编辑技术最常用的手段是CRISPR-Cas9系统，它是一种通过结合RNAs和酶分子来定向剪切DNA的系统。
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
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Center. The Plant Cell 20: 1482-1493.
荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization，FISH). 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原 位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结 合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗 体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
6.6.2 噬菌体展示技术
• 噬菌体是细菌病毒的总称，英文为
Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”
，有“吞噬”之意。
• 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种 不同的类型。
6.6.2 噬菌体展示技术
• 在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞
转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大
量的子代噬菌体颗粒。
人肌糖原磷酸 酶基因在11号 染色体的定位 结果。
6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis).
通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编
码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸
残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体 能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征 序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲
除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除 细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型 基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。
噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母
细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常
物模型，为医学研究提供遗传学数据，
为遗传病的治疗，生物新品种的培育奠
定了良好的基础。
6.2.3植物基因敲除技术
• T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最
为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-
DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列
整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到
目的基因内部或附近，就会影响该基因的
表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编
码序列。
现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先
从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该
基因的功能。
基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，
通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组， 进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性 强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传 等特点。
• 实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体 叫作烈性噬菌体。
6.6.2 噬菌体展示技术
• 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主
细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分
，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具
有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌
体。
6.6.2 噬菌体展示技术
• 噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵
6.6其它分子生物学技术
6.6.1 凝胶滞缓实验
• 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又 叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobilityshift assay），是用于体外研究DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳 技术。
• 该方法简单、快捷，是分离纯化特定DNA结
Expression
pattern of BARD1
In Situ hybridization
Han P, Li Q, Zhu YX. (2008) Mutation in the
Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases
WUSCHEL Expression from the Organizing
• 动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率
为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保 证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了 同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛 选技术验证所获得的确实是目的基因被敲 除的细胞系。
6. 2. 2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建 重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外 源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组，将重组载体中的DNA序列整 合到内源基因组中并得以表达。
RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。
mRNA 的 互 补 链 ， 杂交信号集中于 纤维细胞中。
负对照， mRNA 的 同义链 , 无杂交 信号。
表达，从而使该基因“失活”。
• T-DNA：根癌农杆菌Ti或Ri质粒中的一段
DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合
到植物基因组中，是植物分子生物学中广
泛应用的遗传转化载体。
a.引物设计。LP和 RP分别代表插入基
因两端的引物，LB
是指载体上的一段 引物，目的基因片
段(设为900bp)。旁
邻序列是经测序后 获得的DNA序列。
合蛋白质的经典实验方法。
6.6.1 凝胶滞缓实验
• 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数 成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相 结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶 中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压 和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩 短了。
拟南芥转录因子与不 同DNA元件有不同的 结合能力。
1、 DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端
的主要生物学意义是什么？
2 、 cDNA合成时的方向其主要改进过程。
4、SNP的概念、分类与主要检测方法。
5、请说出蓝白斑筛选的分子机制。
6、5’和3’RACE的主要技术流程。
7、PCR的主要应用途径及基本原理。
，含有该基因的重组细胞不能在选择培养
基上生长。
图6-9 用取代型（a）或插入型
（b）载体进行完全基因敲除实验
图6-10 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同 源重组的细胞
正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA
功能最关键的外显子中，或通过同源重组法 置换靶基因的功能区。 负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段外 侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养 基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负 向选择基因就可能被整合到基因组中，导致 细胞死亡。
”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使 之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组 噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有 杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获 靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。
图6-36噬菌体展示技术研 究蛋白质相互作用。
6.6.3. 蛋白质磷酸化分析技术
• 蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有
多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白
激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶
活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法
能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的
磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。
6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）
技术及其应用
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解 细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细 胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源 于安德鲁〃法尔1998年在《自然》杂志上的论 文。
研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与 之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA） 的降解。
图 6-12 模式动物小鼠中 完全基因敲除的主要技术 策略与应用。
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。
电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。
意义：
• 除了研究基因功能外，基因敲除技术还 被广泛应用于建立人类疾病的转基因动
正对照，UBQ10 杂交信号遍布于 整个胚珠。
Ji S.J. et al. (2003) Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development by subtractive PCR and cDNA array. Nucleic Acids Res. 31: 2534-2543.
8、Gateway大规模克隆技术的原理及基本
过程。
9、基因图位克隆法的原理和过程。
10、说出基因操作与基因工程技术的异同。
11、说出蛋白质组学的基本概念和主要技术手
段，说出基因组与蛋白质组的主要差别。
12、蛋白质免疫印迹实验的原理和过程。
第 六 章
分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术
6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标 记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对 核酸进行定位和相对定量研究的一种手段， 分为RNA和染色体原位杂交两大类。
经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）
的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以
上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干
扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），
并有效地定位目标mRNA。
RNAi作用机 制示意图。
由siRNA中的反义链参与指导合成被称为 RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体， 再由RISC介导切割目的mRNA分子中与 siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶 基因表达的功能。