实验研究2018年4月下
球。吸液时必须充分摇匀疫苗。（6）吸出的疫苗液切不可再注回于瓶内，针筒排气溢出的疫苗液应吸附于酒精棉球上，并将其收集于专用瓶内，用过的酒精棉球、碘酊棉球也应置于专用瓶内，与疫苗瓶一同进行无害化处理。（7）羊只注射部位剪毛后用 碘酊或70～75%酒精棉球消毒，再用挤干的酒精棉球擦干消毒部位。（8）做好记录，填写免疫登记证（表），打上耳标，记录内容包括：耳标号、羊的品种、数量、日龄、疫苗的来源、批次、接种时间等。参考文献[1] 蒋梅，杨仕标，张念祖.小反刍兽疫的流行趋势与防控[J].动物医学进展，2007，28（b08）：88-91.[2] 王昌建.小反刍兽疫[J].湖南农业，2003，（11）：19.[3] 李彦芳.小反刍兽疫的诊断与防控[J].新疆畜牧业，2014，（2）：53-54.摘 要：分析稀释液pH值、试验温度、红细胞浓度和种类等因素是如何影响血凝与血凝抑制试验结果的准确性，避免试验结果偏差的出现，以便更好的指导生产。关键词：血凝；血凝抑制；偏差；pH值；试验温度；红细胞浓度血凝与血凝抑制试验普遍用于禽流感和新城疫的抗体检测，主要用于检验禽流感和新城疫免疫抗体的监测以便指导养殖场制定免疫程序，此试验方法虽简单但某些细节不注意，会引起结果偏差，造成严重的后果。因此熟练的掌握检测方法得出正确的结果非常重要。血凝与血凝抑制试验分为血凝实验和血凝抑制实验两个部分。血凝实验的原理是利用某种病毒的血凝素能与某种动物的红细胞发生凝集的现象叫凝集实验，血凝抑制实验的原理是某种动物的病毒被相对应的特异性抗体中和，从而抑制了某种病毒的血凝素和某种动物的红细胞发生凝集的现象叫血凝抑制实验。1 实验试剂制备中易出现的问题血凝与血凝抑制实验前期需要制备的试剂有阿氏液配制，PBS和1%鸡红细胞等。实验对稀释液的pH值和盐浓度都有要求如下表PBS的PH值禽流感H5抗原效价（1-11孔）PBS对照（12孔）pH值7.29孔完全凝集完全沉淀pH值6.29孔完全凝集完全沉淀pH值5.811孔完全凝集完全凝集在血凝和血凝抑制实验中血凝实验的抗原效价标定异常重要，抗原标定太高检测出的抗体就偏低，抗原标定的偏低检测出的抗体就偏高。实际检测工作中，经常出现抗原效价测定到十二孔都是全完凝集，有可能是新出厂的抗原效价确实很高，这种情况应该多做几个孔直到有沉淀产生才能确定效价，如果多做几孔还是没有沉淀产生首先要考虑下稀释液PH值有没有偏低。2 实验过程中易出现的问题血凝与血凝抑制实验对环境温度的要求较高，一般实验温度要求20～30℃ 如下表 实验温度禽流感H5血凝与血凝抑制反应时间4℃24h左右24℃50min左右37℃25min左右温度4～37℃范围内，温度越高反应的时间越短，实际工作中，常常会出现有的工作人员对实验温度不关注，有时夏天室内温度达到30℃以上还是按冬天的反应时间观察结果，大大的影响了结果的准确性。实验过程中红细胞浓度和品种也会影响实验结果。实验要求1%红细胞，红细胞浓度不够实验结果出现沉淀点太小，不清晰影响实验结果的判定。红细胞浓度过高会出现沉淀孔比实际的多甚至整板都沉淀不符合实际结果。检测水禽禽流感的时候还常常会出现前几孔和最后几孔凝集中间沉淀的现象，那是水禽往往含有非特异性血凝抑制因子导致的，试验中用水禽的红细胞做水禽禽流感可以大大的减少这种现象的发生。血凝与血凝抑制试验有着简单易操作、检验时间短和经济的优点，非常适合做大批量疫病普查。实际生产中也经常使用于疫苗效果评价，动物群体保护力普查等指导生产。试验简单加上大批量的检测，检测过程中常常会忽视一些细节导致试验结果的偏差，本文主要总结检测过程中遇到的问题做一些总结。总之，在进行血凝和血凝抑制试验时应综合考虑各方面的因素，制定一个标准化的操作方法以免对结果的判定产生误差。参考文献[1] 林琳，江斌，林甦，等.福州市某猪场不同日龄猪伪狂犬病血清学检测与评价[J].福建畜牧兽医，2018，（1）：1-3.[2] 闫玲，孙志学，赖莹.几种试验条件对鸡新城疫血凝和血凝抑制试验的影响[J].黑龙江畜牧兽医，1995，（6）：32-34.[3] 蔡仁龙，林少娟，曾文娟.高致病性禽流感的防治[J].福建畜牧兽医，2013，（2）：56-57.血凝与血凝抑制试验工作的几点心得体会陈小丽1 邹 静2（1.三明市农业局，福建三明 365000；2.昌吉州动物疾病预防控制中心，新疆昌吉 831100）
病毒的血凝及血凝抑制试验
有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]
孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。
2.生理盐水，%鸡红细胞悬液。
3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。
2.于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。
3.自右至左依次向各孔加入%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：L）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病毒稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
病毒液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
弃50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - - 4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
论文
禽流感血凝与血凝抑制试验的准确性与效率
肖朝奎（重庆市双桥区农林水务局动物疫病诊断中心４０ ０ ９ ０ ０）
摘要：面对我国养禽业禽流感疫苗的大面积使用，测定其免疫效果是经常性工作，而禽流感血凝与血凝抑制试验是
我市各个区县每月所必做的，怎样作得更科学、更精准、效率更高就是值得探索的话题。时下报道关于“禽流感血凝
与血凝抑制试验时的影响因素”的相关文章很多，众说纷纭。联系实际检测中遇到的问题，综合一下思路，避免出现一
些误导很有必要。
关键词：禽流感血凝抑制 抗原 红细胞 配制 准确 效率
血凝与血凝抑制试验是当前基层最普遍、最具可操作性的
一项监测禽流感抗体的一种试验，它对设备要求不是很高，器 材简单，但正介于此，对操作者的熟练程度就要求相当高，它
不似酶标仪等机器设备的判断具有的直观性与机械性，而在于
人为意识、经验，偶然因素很多。目前在禽流感血凝与血凝抑
制试验方面存在很多问题，会对血凝与血凝抑制试验的意义造
成影响从而导致不正确的结果。联系工作实际和我个人的心得 体会，按禽流感血凝与血凝抑制试验操作顺序，阐述主要观
点： （１）阿氏液与生理盐水配制（２）红细胞悬液的配制与质 量要求（３）４单位抗原配制的准确性。（４）禽流感抗原相的差
异（５）结果判断的时间性．
一、采集鸡红细胞之前，配制抗血凝用阿氏液时，一定
要调ＰＨ值达到６．１①，因为实际工作中氯化钠、葡萄糖、柠檬 酸、柠檬酸三钠四种成分按比例加入，高温灭菌与溶解后测定其
ＰＨ值为４．２４—４．３０之间，此时一定要加入碳酸氢纳上调到６．
１，否则采集的鸡红细胞溶于其中颜色暗淡，沉降过程大大延长 或沉降根本无法进行。另外生理盐水的要求：采用的生理盐水
不能受细菌污染，应无菌，否则会出现对照孔、阳性孔、阴性
（上接１，ｌ０页）
并用木棍搅拌均匀，几秒钟后可见浅蓝色刺激眼鼻的气体蒸发出
来。关闭门窗２４小时，然后打开门窗通风，空合１周后即可进
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--以新城疫为例
实践目的：
1．掌握血凝HA和血凝抑制HI试验的原理
2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法
实践原理：
某些病毒如鸡新城疫病毒,禽流感病毒等能够与人或动物的红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象;这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体免疫血清所抑制,即为红细胞凝集抑制试验;
实践内容：
1．红细胞凝集试验HA试验 主要是测定病毒的红细胞凝集价,以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数抗原单位;有试管法和微量法两种,现以常用的微量法进行说明;
鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法,在V形微量反应板上进行;
1首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴25μl;
2用微量移液器取病毒抗原液25μl加入第1孔内,吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀,再吸取25μl液体小心地移至第2孔,如此连续稀释至第11孔,第11孔吸取25μl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048,第12孔为红细胞对照;
3再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴25μl;
4在振荡器上振荡混匀约l～2分钟,再置37℃作用15分钟后观察结果;
5每次测定样品都应同时做红细胞对照;
表1 鸡新城疫血凝效价HA的测定术式微量法
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病毒稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
生理盐水 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
病毒液 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl
弃去
1％红细胞悬液 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 感作 置振荡器上混匀1～2分钟,放37℃静置15分钟
