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实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2。
蛋白酶产生菌的分离与纯化2。
1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.2。
2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2。
4 实验方法与步骤2。
4.1 分离1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2。
4。
2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
树莓果酒酿造酵母的分离、筛选段晓玲;王金玲;吕长山【摘要】从天然浆果中分离酿酒酵母并进行生理生化分类鉴定,通过红树莓汁的发酵试验从分离到的酿酒酵母中筛选得到适合发酵红树莓果酒的天然酵母.首先通过自然发酵法从不同来源的新鲜树莓、山葡萄、蓝莓中分离得到30株酵母,利用形态及生理生化鉴定方法将30株酵母分成25组;然后在相同条件下接入等量的不同酵母进行发酵,以红树莓果酒的总酸、残糖、乙醇体积分数及感官评价分数为评价指标,从而筛选出适合红树莓果酒酿造的最佳酵母.结果表明,第7组酵母最适于发酵红树莓果酒,所得果酒总酸10.55g/L,残糖4.14g/L,乙醇体积分数为12.2％,果酒具有鲜亮的宝石红色,澄清透亮,果香浓郁,酒体丰满,口味纯正.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2014(040)008【总页数】5页(P84-88)【关键词】树莓果酒;酵母;分离;筛选【作者】段晓玲;王金玲;吕长山【作者单位】东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨,150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨,150040;东北农业大学应用技术学院,黑龙江哈尔滨,150030【正文语种】中文树莓(Raspberry)果实柔嫩多汁，香味宜人，具有很高的营养价值［1-4］。
在已开发的树莓产品中树莓果酒因兼有树莓的营养成分和果酒的醇香爽口，而成为都市崇尚健康人群的新宠［5］。
在果酒的生产过程中，酵母品种的选择是关键，因而受到学者的高度重视［6-10］。
树莓果酒发酵优良菌种的筛选，不仅为树莓果酒研制提供了理论依据，而且促进了树莓产业的发展，提升加工产品的附加值，对改善农业结构也具有重要的意义［11］。
1 材料与方法1.1 材料与仪器野生红树莓、山葡萄、蓝莓、白砂糖市购;酵母从不同来源的蓝莓、山葡萄及树莓中分离;无水Na2CO3、Na2SO3、葡萄糖、KCl、三水醋酸钠、NaCl、Mg-SO4、CuSO4、NaOH、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、HCl、邻苯二甲酸氢钾，天津天力化学试剂有限公司，分析纯。
菠萝果酒酵母的分离及筛选胡月英，陈文学，仇厚援，李从发（海南大学食品学院，海南海口570228)摘要：从成熟的菠萝表皮和果肉分离得到101株酵母菌，经过筛选，最终确定A4C13菌株为最优菌株。
该菌株在SO 2浓度为300mg/L 、pH1.5、乙醇浓度为19%vol 时，均能产气发酵。
且对菠萝汁的发酵能力强，菠萝酒香气浓郁。
关键词：微生物；酿酒酵母；分离；筛选中图分类号：TS262.7；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001－9286（2009）11－0021－03Isolation and Screening of Wine Yeast Strains From PineappleHU Yue-ying,CHEN Wen-xue,QIU Hou-yuan and LI Cong-fa(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou,Hainan 570228,China)Abstract :101yeast strains were isolated from the pericarps and pulp of mature pineapple and a yeast strain numbered as A4C13was screened for pineapple fruit wine fermentation.Yeast A4C13could ferment at 300mg/L SO 2,pH 1.5and 19%vol alcohol content and produce pineapple fruit wine with strong fruit aroma.Key words :microbe;Saccharomyces cerevisiae ;isolation;screening基金项目：国家科技支撑计划课题（2007BAD76B04）。
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4。
5—6.0。
酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化.三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁),葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶;试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上,不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5。
5左右，再分装试管9ml2支/组.4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等.四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗)或土壤5克，加入到100ml无菌水中,充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28—30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊.2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h.3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液,混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
葡萄自然发酵过程中酵母的分离鉴定及优良葡萄酒酵母筛选葡萄酒是一种以葡萄为原料经过发酵工艺制成的酒类，其口感和品质与所用酵母菌种密切相关。
在葡萄自然发酵过程中，酵母菌会附着在葡萄皮上，并参与发酵过程。
本文旨在分离鉴定这些酵母菌，并筛选出优良的葡萄酒酵母。
材料与方法1. 材料（1）原料：葡萄（品种为赤霞珠）、酵母粉、发酵桶、过滤器、实验室用显微镜等。
（2）试剂：麦芽汁、琼脂糖、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、孟加拉红、美蓝等。
2. 方法（1）葡萄皮上酵母菌的分离与纯化将葡萄皮放入麦芽汁培养基中，于30℃培养3-5天。
每天观察并记录菌落形态和数量。
将分离得到的菌株进行纯化，直至获得单一菌株。
（2）酵母菌的鉴定采用形态学和分子生物学方法对酵母菌进行鉴定。
形态学方法包括显微镜观察、革兰氏染色、芽孢染色等；分子生物学方法包括PCR扩增、序列分析等。
（3）优良葡萄酒酵母的筛选将分离纯化得到的酵母菌株分别接种到葡萄汁培养基中，于适宜温度下培养。
观察并记录不同菌株的生长情况、产酒精度等指标。
筛选出发酵性能优良的菌株。
结果与讨论1. 结果经过分离鉴定，我们共得到10种不同的酵母菌株。
通过形态学和分子生物学方法对这些菌株进行鉴定，确定它们分别属于酿酒酵母属、毕赤酵母属等不同种类。
在葡萄酒发酵性能测试中，发现某些菌株具有较高的发酵活性和酒精产量。
具体数据如下表所示：2. 讨论本研究从葡萄皮上分离得到了10种不同的酵母菌株，并对其进行了鉴定和发酵性能测试。
结果表明，这些菌株在葡萄酒发酵中具有不同程度的活性。
其中，S3、S7和S10菌株的发酵活性和酒精产量较高，具有作为优良葡萄酒酵母的潜力。
后续研究可以进一步探讨这些菌株在不同酿造条件下的表现和遗传特性，为实际生产中的酵母选育提供理论依据。
同时，对于筛选出的优良菌株进行基因组学和蛋白质组学方面的研究，有助于深入了解其代谢机制和生物学特性，为葡萄酒品质的提升提供技术支持。
《酿酒酵母的分离纯化》实验设计一、实验目的1、学习并掌握酿酒酵母的分离纯化技术；2、复习血清记数法和培养基的配制操作；3、巩固显微镜的使用。
二、基本原理酵母菌是一类单细胞真菌，一般成圆形，椭圆形和圆柱形。
无性繁殖以芽殖为主，也有少数是裂殖，有些酵母菌能产生子囊孢子，有的酵母菌能形成假菌丝。
酵母菌的菌落近似细菌的菌落。
但较大且厚，多呈白色。
酵母菌在液体中生长可形成菌膜，菌环，沉淀和混浊，酵母菌的细胞结构较完整即有壁、膜、质、核等结构。
酵母菌的细胞形态、繁殖方式和培养特征均为菌种鉴定的依据。
分离纯化即从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。
平板分离的方法主要有平板划线分离法和稀释涂布平板法，后者除能有效分离纯化微生物外，还可以用于测定样品中活菌数量。
另外还有混菌法分离。
平板菌落记数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中的细胞密度。
由于待测杨平往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是耽搁细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或多个细胞。
因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
显微计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定的容积的载玻片上，于显微镜下直接观察、计数的方法。
本实验用血细胞计数板进行计数。
血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。
中间较宽的平台又被一横槽隔成两半，每边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。
每一个大方格都有400个小方格。
每一个大方格边长1mm，则每一个大方格的面积1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度0.1mm,所以计数室的容积为0.1mm3。
计数时，通常数5个中格的总菌数，然后求得每个中格的平均值，再根据下式计算：1mL菌液中的总菌数=A/5*25*104*B(A为5个中格的总菌数，B为菌液稀释倍数)三、实验准备仪器：无菌试管（根据稀释倍数暂定大试管7个、用作斜面的小试管3个）、无菌培养皿6个、无菌涂布器3个、无菌移液管1ml的7个，接种环、带玻珠的无菌三角瓶、酒精灯、血细胞计数板、盖玻片、显微镜。
酿酒酵母分离纯化实验报告
酿酒酵母分离纯化实验报告：本实验中使用了四个不同的抑制剂，乙酸、乙酰乙酸乙酯、低浓度苯酚和醋酸，对原始水抽出的酿酒酵母进行了分离纯化。
根据实验数据，发现乙酸和乙酰乙酸乙酯有助于抑制非酿酒酵母菌株和其他微生物菌群增长，可以有效分离酿酒酵母。
低浓度苯酚可以使非酿酒酵母菌群的增长速率大幅下降，而醋酸可以减少正常葡萄酒的发酵速率。
总的来说，本实验表明，通过使用四种不同的抑制剂，可以有效地分离和纯化酿酒酵母，从而提高酿酒质量。
果酒是以果品为原料经发酵酿制而成的低度饮料酒，酒度一般在12％(v/v)左右。
果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质（SOD），经常饮用能治疗贫血病，防止动脉硬化、高血压和脑血管疾病等。
果酒酒度低，对人体和神经没有强烈的刺激感，加之具有独特的风味和色泽，故深受广大消费者的青睐。
在果酒的整个生产过程当中，酵母品种的选择是果酒酿造的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，因此果酒酵母筛选历来倍受重视。
近年来，随着果酒产业的发展，经过科研人员不断深入研究，在果酒酵母选育方面取得了良好进展，并逐渐形成了有一定特色的果酒酵母产业。
1 果酒酵母的种类目前，我国果酒企业多使用葡萄酒酵母来酿造果酒，工业果酒酵母分离选育的研究进展魏彦锋1，蒋锡龙2，孙玉霞2，史红梅2，张久慧2（1.山东省九州食品生产力促进中心，济南 250100；2.山东省酿酒葡萄科学研究所，济南 250100）摘 要：果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。
野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，所酿果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。
关键词：果酒酵母；分离；选育；进展生产中通常加入人工培养的纯酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )。
随着果酒工业化的进展以及人们消费水平的提高，发现单纯用已筛出的酿酒酵母作为发酵菌种酿造出的果酒，通常都存在着风味过于平淡的缺陷。
为更好的适应果酒市场需求，在生产过程中引入非酿酒酵母，使果酒风味有了明显改善，进一步提高了果酒的品质。
1.1 纯酿酒酵母利用纯培养技术，在果酒发酵培养基中接入纯酿酒酵母，使整个发酵过程具有启动快、发酵能力强，能耐受一定的SO 2和乙醇的能力，并且能使发酵过程进行完全，残糖含量少，酒精含量高，果酒酒体协调，酒质清淡。
果酒酵母发酵及菌种保藏实验目的1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2．用实验三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。
3．了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4．学习常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。
加0.8ml亚硫酸6%。
5、糖度测量：取5ml苹果汁稀释20倍定容至100ml，取3ml 稀释液，加50ml蒸馏水，加菲林试剂A、B液各5ml于250ml 的三角瓶中，加热煮沸，煮沸2分钟后加2滴次甲基蓝指示液，滴加葡萄糖标准溶液，总共消耗17.8ml葡萄糖标准溶液酸度测量：5.00 mL苹果汁稀释20倍定容至100ml，取3ml 稀释液，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。
起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。
6、果汁调整：糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需[文档可能无法思考全面，请浏览后下载，另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意!]。
专业实验报告（果酒发酵）引言果酒是一种由水果经过发酵过程制成的酒类饮料。
传统的果酒是使用水果中的糖分通过酵母发酵得到的，酵母通过代谢糖分产生的酒精使果酒产生醉酒的效果。
本实验旨在探究果酒发酵过程中的关键参数，以提高果酒的质量和产量。
实验目的1. 探究果酒发酵过程中的最佳温度条件。
2. 了解果酒发酵过程中的酵母菌种类的影响。
实验材料与方法材料：1. 水果（如苹果、梨、草莓等）2. 酵母（干酵母或液体酵母）3. 白砂糖4. 水方法：1. 将选定的水果清洗干净，去皮去核，切成适当大小的块状。
将水果放入一个干净的发酵桶中。
2. 在发酵桶中加入适量的白砂糖，根据水果的甜度添加。
3. 在另一个容器中，将酵母与适量的温水（35-40）混合搅拌均匀，待酵母活跃起泡后，将其倒入发酵桶中。
4. 将发酵桶盖好，放置在恒温箱中进行发酵。
设置不同的温度条件，如20、25和30。
5. 每隔一段时间，通过测量酒液中的酒精含量、pH值和重量等指标，评估发酵过程的进展。
6. 在发酵结束后，用滤纸过滤掉果酒中的悬浮物，将果酒装入干净的容器中存放。
实验结果与讨论温度与果酒发酵在本次实验中，我们分别设置了20、25和30三个不同温度条件下的果酒发酵过程。
通过对比各项指标的变化，我们可以得出如下结论：1. 发酵速度：随着温度的升高，发酵速度也随之增加。
在30的条件下，酵母活跃度较高，发酵速度最快。
而在20的条件下，由于温度较低，发酵速度较慢。
2. 酒精含量：发酵过程中，酵母通过代谢产生乙醇，从而使果酒中的酒精含量增加。
在30的条件下，酵母菌活跃度较高，因此酒精含量最高。
而在20的条件下，由于酵母活跃度较低，酒精含量较低。
3. pH值：发酵过程中，酵母代谢糖分产生的乙酸导致果酒的pH值降低。
我们观察到，在30的条件下，果酒的pH值较低，呈现出更酸性的特点。
酵母菌种类对果酒发酵的影响除了温度，酵母菌的种类也对果酒发酵过程产生影响。
在本次实验中，我们使用了干酵母和液体酵母进行对比实验。
北方民族大学实验方案果酒酵母的分离、纯化及选育果酒酵母发酵院(部)名称：生物科学与工程学院******** 20092474隆冬玲 20092499马忠孝 20092526张晶 20092475张静艳 20092462专业:生物工程指导教师姓名:倪志婧实验三果酒酵母的分离、纯化及选育原始数据记录1.筛出5株酵母菌2.发酵力试验：采用CO2失重法不同酵母菌株在发酵过程中CO2失重的动态变化不同发酵时间（d）下三角瓶的重量/g原重1d 2d 3d 4d 5d 6d CO2释放量菌种1 164.8 163.82 161.51 159.43 158.24 157.25 155.49 9.31菌种2 152.5 151.83 150.85 149.38 148.34 147.32 145.94 6.56菌种3 158.4 156.73 154.78 152.99 152.1 151.24 150.04 8.36菌种4 155.1 153.97 152.04 150.34 149.42 148.66 147.7 7.4菌种5 156.1 155.22 152.86 151.02 149.95 149.28 148.15 7.95从上表可以看出1号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即1号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。
不同发酵时间（d）CO2释放量/g1 2 3 4 5 6菌种1 0.98 2.31 2.08 1.19 0.99 1.76菌种2 0.67 0.98 1.47 1.04 1.02 1.38菌种3 1.67 1.95 1.79 0.89 0.86 1.2菌种4 1.13 1.93 1.7 0.92 0.76 0.96菌种5 0.88 2.36 1.84 1.07 0.67 1.13从上表可以看出1号和5号菌株在发酵开始时CO2释放量（g）最快，即1号和5号菌株发酵力最强。
3.耐受性试验做1号菌株和5号菌株的耐受性试验：采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8% 、9%）二氧化硫（30、50、60、90、120 mg/L）的耐性。
从上表可以看出1号和5号菌株对二氧化硫耐受力基本相同，5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。
实验方案果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。
果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。
酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。
果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。
野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。
本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化3-5株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。
一、实验目的和内容 1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。
二、实验原理酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。
（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。
（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。
（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。
（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。
要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。
果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。
根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。
为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
三、实验仪器与材料样品：苹果YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml.PDA培养基（酿酒酵母培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。
121℃灭菌30分钟。
）器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
四、实验方法与步骤酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。
在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
(1)．酵母菌的分离初筛1）菌种采样样品土壤叶片果实（带柄）腐果瓜根际土壤藤下方土壤垄间隙土壤采集方法用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴好无菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。
用无菌剪刀剪取不同生长阶段的叶片装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜（幼龄期，膨大期，成熟期）分别装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。
随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。
2）富集培养与纯种分离方法一：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。
待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。
待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。
菌种划线三到四次后基本纯化。
方法二：将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。
腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养。
待长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。
菌种划线三到四次后基本纯化。
(2)．酵母菌种的复筛选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。
将初选菌种接入保藏培养基。
培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 ℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 ℃下发酵。
发酵过程中每24h 测定1次CO2损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。
随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻，直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。
(3)．酵母菌的耐受性试验采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16% 、18% 、20% ）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L）的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。
活化条件：28 ℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；接种量：1×107 cfu/mL。
1）耐酒精度试验采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml，再以水果原汁为培养基，制成含酒精量为10%、12%、14%、16% 、18%系列的液体培养基。
按下表在试管中加入果汁。
然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。
灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。
最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。
观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：试管编号0 10 12 14 16 18 20 95%酒精/mL 0 1.05 1.26 1.4 1.68 1.90 2.15果汁/mL 10 8.95 8.74 8.60 8.32 8.10 7.85培养液含酒精%（v/v）0 10 12 14 16 18 202）耐SO2试验按亚硫酸含量为6% 计，计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。
灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。
最后在每发酵管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。
观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号0 1 2 3 4 5亚硫酸/uL 0 10 17 20 30 40果汁/mL 10 10 10 10 10 10培养液含SO2mg/L 0 60 100 120 180 240五、技术指标1．富集培养：指从微生物混合群开始，对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法富集培养基：富集培养所采用的培养基为富集培养基富集培养基的作用：使混合微生物中的特定种的数量比例不断增高，并引向纯培养。
2.酵母菌镜检：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。
因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。
3.血球计数板的使用以计数酵母菌为例(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片.(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中计算公式(1)16格×25格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数(2)25格x16格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数六、实验时间进程表1.3月11日10:00-12:00配制YEPD培养基（富集培养基），配制PAD培养基（酿酒酵母培养基）将买来的苹果削皮，把果皮放到研钵捣碎，等待接种用2.3月11日16:00-18:00将配制好的YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适果皮各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天将PDA培养基灭菌，倒平板将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养3.3月14日16:00-18:00将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。
