植物组织培养技术实验指导

植物组织培养试验《植物组织培养技术》实验指导实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌一、目的要求：1.通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。

2.通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。

二、材料用具：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。

三、说明：在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的,总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。

植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染,第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒,使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。

四、方法和步骤：首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml 粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。

此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。

每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净一泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷f清水反复冲洗f蒸馏水淋一遍f烘干备用。

然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净f晾干一侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定f清水反复冲洗干净f蒸馏水淋洗一遍f烘干备用。

带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时,再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。

生物技术大实验第一部分植物组织培养实验一、母液的配制和保存（3学时）一、实验目的通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。

二、原理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。

使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩10倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩100倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩100倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩100倍）等。

三、实验仪器设备和试剂冰箱，天平，酸度计，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(100ml，500ml，1000ml)，药勺、称量纸、滴管、玻璃棒，电炉，微波炉NH4NO3, MnSO4.4H2O, KNO3, ZnSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, Na2MoO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KH2PO4, CoCl2.6H2O, H2BO3，Na2•EDTA•2H2O，KI, FeSO4.7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水四、实验方法1、MS大量元素母液的配制配制时先用量筒量取蒸馏水大约350ml，放入500ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入500ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2、MS微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O，ZnSO4•7H2O ，H2BO3，KI ，NaMoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容，装入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

植物组织培养实训指导书《植物组织培养技术》是生物技术及应用专业的工学结合核心课程之一。

本课程采取“项目引领，任务驱动”的教学模式，使学生掌握植物组织培养技术的职业知识和职业技能，能够在实际工作中具备实验方案设计能力、培养基制备能力、无菌操作能力、组培苗驯化移栽能力及组培苗工厂化生产能力。

实训一：实训室的灭菌与玻璃器皿的清洗一、目的要求1.通过实训，使学生了解各种洗涤液的特性；2.掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器皿的洗涤技术；3.通过实训，培养学生良好的卫生习惯，建立组织培养的无菌意识；4.会配制新杰尔灭溶液。

二、材料用具1.灭菌用具：2%新洁尔灭、高锰酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、各种培养皿、工作服、口罩、手套、试管刷。

2.洗涤用具：肥皂液、洗衣粉、重铬酸钾粉末、1%HCL、70%酒精、瓶刷等。

三、方法步骤（一）培养室的灭菌1、地面、墙面和工作台的灭菌2、无菌室和培养室的灭菌（二）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。

重铬酸钾洗涤（三种）液配制：重铬酸钾50g，加1L蒸馏水，加热溶化，冷却后再缓缓加入工业浓硫酸90ml。

1、新玻璃器皿的洗涤用1%HCL的溶液浸泡一昼夜，再用清水反复洗涤，最后用蒸馏水冲淋一遍，干燥后备用。

2、用过的玻璃器皿先将器皿中得残留物质除去，用清水冲洗，再用洗衣粉洗涤，最后用清水冲洗3～4遍，把字迹擦洗干净，干燥后使用。

3、污染的培养瓶的处理首先经高压蒸汽灭菌，再按（2）的步骤洗涤。

4、用过的吸管、滴管、容量瓶先放在重铬酸钾溶液浸泡2h以上，取出后经流水冲洗30min左右，干燥后使用。

四、实训报告①.植物组织培养室的灭菌方法步骤。

②.写出洗涤液的配置步骤。

③.记录各种培养瓶的洗涤方法。

实训二：组织培养工厂的设计一、目的要求通过实训，使同学们对现代组培苗生产模式有一个更为深刻的认识，能熟练的根据生产规模设计合理的厂房及工艺流程。

二、材料用具组培苗生产小工厂、绘图纸、绘图笔三、方法步骤(一) 组培工厂的参观1．参观组培实验中心2．组培工厂的组成：准备室、灭菌室、缓冲室、无菌室、培养室、驯化室3．各室内仪器设备的种类及摆放(二) 设计一200m2组培工厂，要求绘出大概的布局图。

第五章植物组织培养技术实验方案一、实验目的：1.了解植物组织培养的基本原理和方法。

2.掌握植物组织培养的实验操作技巧。

3.培养植物组织并观察其生长和发育情况。

二、实验材料和设备：材料：麦芽糖、琼脂、植物激素（如IAA、ABA、GA3等）、幼绿豆胚轴组织。

设备：平板培养器、显微镜、高压锅、移液器、无菌操作器具等。

三、实验步骤：1.制备琼脂培养基a）称取适量琼脂加入适量蒸馏水中，搅拌均匀。

b）高压锅加热至沸腾，放入琼脂溶液，保持沸腾10-15分钟，使琼脂充分溶解。

c）将高压锅冷却后取出，倒入洁净的培养器中，晾凉并凝固。

2.准备植物组织a）将绿豆种子浸泡于水中，待种子发芽至一定程度。

b）取出绿豆胚轴组织，用刀切割成适当大小的组织片段。

3.制备植物组织培养基a）取适量砂糖和植物激素（如IAA、ABA、GA3等），溶解于蒸馏水中。

b）加入适量制备好的琼脂培养基，搅拌均匀。

4.进行组织培养a）将准备好的植物组织片段放入培养器中，倒入制备好的植物组织培养基，使组织片段完全浸没其中。

b）盖上培养器盖子，用透明胶带密封，防止细菌浸入。

c）将培养器置于适当的温度和光照条件下，进行培养。

5.观察和记录a）每天观察组织的生长和发育情况，记录变化。

b）使用显微镜观察细胞结构和细胞分裂情况。

c）观察是否有细菌感染或其他异常情况。

d）记录实验数据，如生长速率、生长周期等。

四、实验要点：1.所有实验操作都要在无菌环境下进行，避免细菌和其他微生物的污染。

2.组织培养基的配方可以根据不同的植物种类和研究目的进行调整。

3.培养条件也根据不同植物种类的要求进行调整，如温度、光照等。

4.实验中要注意观察并记录实验数据，对结果进行分析和总结。

五、预期结果：通过植物组织培养技术，可以观察到植物组织的生长和发育情况，研究不同因素对植物生长的影响，培养出健康的植物组织，为其他相关研究提供基础数据和实验材料。

六、安全注意事项：1.操作时要小心使用实验器具，避免切伤或烫伤等事故发生。

实验一培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制实验二植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌实验三番茄子叶愈伤组织诱导培养阿实验四马铃薯茎段的扩繁培养实验五海棠叶片的离体培养实验六胡萝卜离体根的培养实验七组织培养物的继代培养实验八马铃薯脱毒与组培快繁实验九沙棘组织培养实验方案设计及实施实验一培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制常用组织培养的玻璃容器及接种用的玻璃器皿如锥形瓶、培养皿、试管、配置培养基用的试剂瓶、烧杯等以及金属的镊子、剪刀、接种铲等，用前必须经过洗涤，有的还要消毒。

一器皿的洗涤方法1.一般玻璃器皿，特别是第一次使用的新的玻璃器皿，首先用清水充分浸泡后用碱水刷洗，然后用清水充分除去碱液，再用无离子水或蒸馏水刷洗干净后烘干或晾干，待用。

检查玻璃器皿是否洗刷干净的标准是：洗后的玻璃器皿沾水后，布满于整个玻璃表面并形成完整的水膜，而不会有不均匀的水珠出现。

当玻璃器皿十分肮脏，带有不同的污渍时，则需要特殊的洗涤液浸泡4-12小时，然后再用清水漂洗干净，较常用的是铬酸洗液，它是用重铬酸钾加入浓硫酸配制而成，其腐蚀性极强，对衣物、皮肤等均十分有害，一般尽量避免使用。

目前生产有各种合成的化学洗涤剂，可清除各种污物，使用方便，是实验室内常用的。

2.金属用具在第一次使用前必需先用四氯化碳或乙醚等有机溶剂将其表面的防锈油擦洗干净，用布擦干方可使用，每次使用后需用水清洗并保持干燥。

二器皿及环境的消毒方法器皿的消毒方法分为：1.物理方法又可细分为：（1）干热消毒法（Dry heat sterilization）：适用于玻璃器皿、金属和一些不怕高温的物品，如培养皿、锥形瓶、各种试剂瓶、刀、剪、镊子等。

一般在150℃烘箱内烤2-3小时，在消毒灭菌前将所要消毒的物品包装于固定容器或耐热的包装材料内（如饭盒、培养皿灭菌筒、铝箔纸等），防止在使用前的再次污染。

（2）湿热消毒法（Wet heat sterilization）：不能用干热消毒的物品，如配置好的培养基、易燃的棉花、工作服、口罩等，要使用高压灭菌锅，通过水蒸气压达到灭菌消毒的目的，常用气压为15磅或1.2kg/cm2，温度为121-124℃，灭菌20分钟即可达到杀灭细菌、消毒的目的。

植物组织培养实验指导《植物组织培养实验指导》《植物组织培养实验指导》的相关说明一、本指导用于《植物组织培养概论》课程的实验教学。

二、各专业班级根据实际情况做相应调整，调整情况详见各专业班级的授课计划。

其中15个课时的内容调整如下：实验一、二、五3学时实验六 3学时实验七 3学时实验九、实验十二 3学时实验十三 3学时实验一实验室基本设备及其用途的识别一、目的认识植物组织培养实验室的基本结构，必须的基本设备及其用途与作用方法。

二、实验室的基本结构（一）化学实验室（工作室）培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析；制蒸馏水。

设备、药柜、工作台、蒸馏水器、天平、冰箱，手提高压消毒锅、显微镜、解剖镜、各种玻璃仪器、金属仪器等。

安装水、电、排气等装置。

（二）接种室①无菌操作室②接种箱③超净工作台（三）培养室（四）洗涤、消毒室；卧式高压消毒锅。

（五）温室（培养大棚）。

实验二常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制一、目的认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制。

二、常用仪器1.蒸馏水器（学习操作）2.手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作）3.天平⑴药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）⑵扭力天平（精密度1/100）⑶分析天平（精密度1/10000）4.超净工作台（学习、使用、操作）5.电热干燥箱（烘箱）6.恒温光照培养箱（学习、操作）7.电冰箱8.显微镜和解剖镜①手提式解剖镜（学习、使用、操作）②立体解剖镜③普通显微镜9.旋转培养机10.离心机（学习、使用、操作）11.酸度测定仪：⑴精密PH4－7试纸；⑵笔型袖珍酸度计。

三、必要的器皿（一）玻璃器皿1.培养器皿①试管②三角烧瓶（锥形瓶）③圆形高形培养瓶（罐头瓶）④培养皿⑤扁身培养瓶⑥L型和T型管⑦凹面载玻片2.盛装器皿①试剂瓶②烧杯3.计量器皿①量筒②容量瓶③吸管4.其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。

一、实验背景植物组织培养技术是一种在无菌条件下，将植物的茎尖、茎段或叶片等切成小块，通过人工方法在特制的培养基上进行培养，使其逐渐发育成完整植物体的技术。

本实验旨在让学生了解植物组织培养的基本原理，掌握实验操作技能，培养学生的创新意识和实践能力。

二、实验目的1. 了解植物组织培养的基本原理及应用。

2. 掌握植物组织培养实验的操作步骤。

3. 培养学生的创新意识和实践能力。

三、实验材料与仪器1. 材料：植物茎段、叶片、茎尖等；培养基；植物激素；消毒剂等。

2. 仪器：无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、培养皿、移液器、解剖刀、镊子、滤纸等。

四、实验步骤1. 准备实验材料：选取健康的植物茎段、叶片或茎尖，去除杂质，清洗干净。

2. 消毒：将实验材料用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水清洗，用消毒剂处理1-2分钟。

3. 切割材料：用解剖刀将消毒后的实验材料切割成适当大小的小块。

5. 培养：将接种后的培养皿放入培养箱中，控制温度、光照等条件，进行培养。

6. 观察与记录：定期观察植物组织的生长状况，记录实验现象。

五、实验注意事项1. 实验过程中需严格无菌操作，避免污染。

2. 切割材料时要注意刀片的消毒和更换。

3. 培养过程中要定期观察，调整培养条件。

4. 实验结果可能存在差异，要注重数据分析与讨论。

教案编写仅供参考，具体实验操作请根据实际情况进行调整。

祝实验成功！六、实验拓展1. 探索不同植物激素对植物组织培养的影响。

2. 尝试用植物组织培养技术繁殖难生根或珍贵植物。

3. 研究植物组织培养在基因工程中的应用。

七、实验报告要求1. 描述实验材料、仪器和实验步骤。

2. 记录实验现象和结果。

3. 分析实验结果，探讨可能的原因。

4. 提出实验中存在的问题及改进措施。

八、实验评价1. 评价学生对植物组织培养原理的理解。

2. 评价学生对实验操作的熟练程度。

3. 评价学生对实验现象的观察与分析能力。

4. 评价学生在实验过程中的团队合作精神。

植物组织培养实训指导书《植物组织培养技术》是生物技术及应用专业的工学结合核心课程之一。

本课程采取“项目引领，任务驱动”的教学模式，使学生掌握植物组织培养技术的职业知识和职业技能，能够在实际工作中具备实验方案设计能力、培养基制备能力、无菌操作能力、组培苗驯化移栽能力及组培苗工厂化生产能力。

实训一：实训室的灭菌与玻璃器皿的清洗一、目的要求1.通过实训，使学生了解各种洗涤液的特性；2.掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器血的洗涤技术；3.通过实训，培养学生良好的卫生习惯，建立组织培养的无菌意识；4.会配制新杰尔灭溶液。

二、材料用具1.灭菌用具：2%新洁尔灭、高镒酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、各种培养血、工作服、口罩、手套、试管刷。

2.洗涤用具：肥皂液、洗衣粉、重铬酸钾粉末、1%HCL、70%酒精、瓶刷等。

三、方法步骤（一）培养室的灭菌1、地面、墙面和工作台的灭菌2、无菌室和培养室的灭菌（二）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器血的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。

重铬酸钾洗涤（三种）液配制：重铬酸钾508，加工蒸馏水，加热溶化，冷却后再缓缓加入工业浓硫酸90ml。

1、新玻璃器血的洗涤用1%HCL的溶液浸泡一昼夜，再用清水反复洗涤，最后用蒸馏水冲淋一遍，干燥后备用。

2、用过的玻璃器血先将器血中得残留物质除去，用清水冲洗，再用洗衣粉洗涤，最后用清水冲洗3—4遍，把字迹擦洗干净，干燥后使用。

3、污染的培养瓶的处理首先经高压蒸汽灭菌，再按（2）的步骤洗涤。

4、用过的吸管、滴管、容量瓶先放在重铬酸钾溶液浸泡2h以上，取出后经流水冲洗30min左右，干燥后使用。

四、实训报告①.植物组织培养室的灭菌方法步骤。

②.写出洗涤液的配置步骤。

③.记录各种培养瓶的洗涤方法。

实训二：组织培养工厂的设计一、目的要求通过实训，使同学们对现代组培苗生产模式有一个更为深刻的认识，能熟练的根据生产规模设计合理的厂房及工艺流程。

二、材料用具组培苗生产小工厂、绘图纸、绘图笔三、方法步骤（-）组培工厂的参观1.参观组培实验中心2.组培工厂的组成：准备室、灭菌室、缓冲室、无菌室、培养室、驯化室3.各室内仪器设备的种类及摆放（二）设计一 200m2组培工厂，要求给出大概的布局图。

《植物组织培养》实验指导教师：任峻目录实验一参观植物组织培养实验室实验二培养基母液配制实验三培养基配制与灭菌实验四植物快速繁殖培养实验考核一、课程的性质与任务植物细胞工程实验技术一般包括植物细胞组织离体培养技术、细胞融合技术、细胞拆合技术、外源基因转移技术等一系列重要的基础技术。

通过实验课程的学习，实验方法立足于初学者的专业基础和一般实验室的条件，将《植物细胞组织培养技术》课程的理论知识、一般的实验技能和科学研究的初步方法融为一体。

培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。

二、实验的目的与基本要求通过本课程的学习使学生掌握植物细胞工程技术的基本原理和实验操作方法，掌握植物细胞体外培养技术，结合科研和生产实际，提高学生分析问题、解决问题的能力。

以适应今后在教学、科研和生产开发等各方面对当代生命科学人才知识结构的需求。

在实验教学过程中，要求学生学习态度严谨，操作动作规范，观察记录耐心细致，独立思考，综合分析实验结果，充分理解后认真地完成实验报告。

09本《植物组织培养》实验考核一、考核方式：实验操作。

二、考核时间：三、考核地点：四、监考教师：实验考核以实验操作形式进行，根据实验4或实验5实验的实验结果（失败或成功）决定实验方案，如果失败，分析失败原因，提出改进措施，在重做中进行实验操作考核，如果成功则继续下一步的实验，实施实验操作考核。

二．考核办法：考核方法主要观察学生的实验操作是否正确，污染率是否高，并要求学生写出实验报告，总结实验中常出现的问题。

在3个课时内小组协作完成实验内容。

包括以下几个方面：1．对实验仪器设备的选择及操作。

湿热灭菌操作过程；无菌操作过程。

2.培养基的配制试剂的配制；母液的移取；实验配方计算。

3.培养条件的设置。

4.实验报告的规范性与科学性。

实验一 参观植物组织培养实验室一、实验的目的和要求掌握植物组织培养实验室的设计要点和必备的仪器设备。

二、实验内容：1. 植物组织培养实验室的设计要点。

《植物组织培养技术》实验教学准备工作一、配制母液所需药品、器材1、 Ms成分19种（N6同）2、蔗糖3、琼脂4、激素（NAA、6-BA、IBA、IAA、KT、ZT等）电子天平、（试管）、容量瓶、烧杯、称量瓶、吸水纸、角匙、母液瓶（棕色）、蒸馏水二、无菌室所需物品1、95%酒精、70%酒精、新洁尔灭、甲醛、高锰酸钾、紫外灯、工业酒精2、枪式镊子（16 cm,20cm）、尖镊（16cm）、解剖刀、柄、接种针、手术剪、喷雾器、药棉、纱布、火柴• 3、广口瓶若干、酒精灯、漏斗、无菌培养皿三、学生配制培养基、分装、高压灭菌所需器具1、培养瓶（PP,120ml三角瓶）(15mm*145mm试管)2、电炉3、烧杯（1000ml）移液管（ 10ml、5ml、2ml、1ml）、吸球4、量筒（100ml、50ml）、角匙、天平、剪刀、吸水、纸5、pH值精密试纸（5.4-7）6、氢氧化钠、盐酸（1N）、蒸馏水、牛皮纸、棉绳7、试剂瓶、（激素、酸碱）、滴管、标签、玻棒四、消毒剂（处理外植体）升汞（氯化汞）、酒精、漂白粉、双氧水、次氯酸钠实验一、 Ms培养基的配制、分装和灭菌植物组织培养的成功与否，除培养材料本身的因素外，第二个因素就是培养基。

应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。

另外植物组织培养是在无菌条件下培养植物的技术。

要达到无菌操作和无菌培养，必须有一定的无菌环境（高压灭菌，无菌室，超净工作台等），使用无菌的容器和用具，进行无菌操作，使培养的植物材料在一定的温度、湿度、光照、营养条件下，生长、发育和繁殖。

一、目的要求学习常用培养基母液的配制方法、培养基的分装和灭菌技术二、实验用品1、仪器•高压灭菌锅、天平、电炉2 、玻璃器皿•烧杯、量筒、移液管、、玻棒、吸球、培养瓶、培养皿、500ml三角瓶、角匙、吸水纸3、药品与试剂•Ms母液（见表1-1）氢氧化钠1N、盐酸1N、蔗糖、琼脂、2，4-D（1mg/ml）、NAA（1mg/ml）、蒸馏水三、实验方法（一）、培养基的配制配制培养基前要先配制母液。