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摘要
利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。
关键词
土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养
前言
在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
实验目的
1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的
方法；
2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；
3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；
4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室
培养法观察鉴定未知真菌。
实验原理
一、经典分类鉴定方法
以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。
二、现代分类鉴定方法
1．微生物遗传型的鉴定
（1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素：
*解链温度法（Tm值）
*(G+C)mol%值只能做否定判断；
*（G+C）mol%值差别>5，属不同的种；
差别>10，属不同的属。
（2）核酸分子杂交法
*DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专
一性。
结论：
I DNA同源性≥ 60% （同种）
II DNA同源性≥ 70% （同亚种）
III DNA同源性60~ 70% （不同亚种）
IV DNA同源性20~ 60% （同属）
（3）16s rRNA作为细菌进化的计时器
本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。
实验整体思路：
在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；
通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；
对得到的纯种细菌染色并镜检，利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；
根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；
运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；
根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位。
实验仪器及材料
1.土样：18号土样
2.试剂及培养基
a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分
离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培
养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基
b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%
乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等
3.仪器
锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20
支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮
纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等
实验步骤
A.细菌的筛选，分离纯化及鉴定
1.细菌的筛选
a)土样处理
i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水，用移液管各移取
9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧
瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；
ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃
恒温培养箱中静置15min。
b)果胶酶菌种筛选
i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌
水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两
种稀释度的土壤溶液（如下图）；
ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种
稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1
两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位
置，每皿准确放入，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，
其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然
后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向
用涂布棒再涂布几次；
iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；
iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透
明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；
v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不
整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记
录；
2.细菌的分离纯化
a)划线分离：制备果胶酶划线培养基，
灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌
种，第一次划线分离培养1-2天后取
分离所得单菌落再进行第二次划线分
离，划线分离的具体方法是：先在平
皿上划定区域，然后将接种针在火焰
图细菌的划线分离示意图
