蛋白水解液中多肽含量的测定方法(1)
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水解度指标测定
水解度的测定方法一：（前三酮比色法）（1）标准曲线制定:1、20 g/ml甘氨酸：2mg甘氨酸定容到100ml容量瓶中。
2、前三酮显示剂：水合前三酮0.5g ,果糖0.3g，磷酸氢二钠11.2g ,磷酸二氢钾6g,定容到100ml.稍热溶解，避过低温保存1周。
3、40%^醇标准曲线制作试管0 1 2345678待测样品标液ml0.000.1 0.20.30.40.50.60.7 1.00.5蒸储水ml 2.00 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.00 1.5前二酮显示剂ml1 1 1摇匀，沸水浴115min,1 1 1用冷水迅速冷却至室温11140%^醇ml5 5 55555555甘氨酸gOD(570nm)0 2 46810121420??因甘嬴酸的分子量为：75.07,换算成-NH?的呻。
1数的AQ关系: 水解度计算公式：DH-—>100%水解液-心曲含萼5凹一原料蛋白质中游高_也含量（响0 g）h^irnmol/g)xioo%所以米糠蛋白的加广7・3477N----水解液蛋白含量（凯氏定氮）F-----米糠蛋白换算系数5.95方法二：采用甲醛滴定法。
水解度（%）=（水解后生成的氨基氮的量/样品中总氮含量）X 100%（1）粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法。
（2）氨基氮的测定氨基酸含有氨基和埃基，具有两性，加入甲醛与氨基酸中的氨基作用，可消除其碱性，使埃基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，即可对氨基酸进行定量。
1、酚猷指示剂：0.5g酚猷溶丁100ml 50%的乙醇中2、中性甲醛溶液：甲醛溶液（36-37%,分析纯）50ml，加入0.5%的酚猷指示剂约3ml，滴加0.1mol / L NaOH使溶液显微粉色，储存丁棕色瓶中，临用前配制。
具体方法如下：分别吸取2mL不同水解度的水解液丁烧杯中加蒸僻水5mL,向烧杯中加入5滴酚猷指示剂，混合后加中性甲醛溶液 2.0ml再混合，用0.1mol /L NaOH滴定显微粉色。
多肽药物的含量测定方法
实验器材
确保实验所需的所有仪器和设备都已准备齐全，并经过校准，以 确保实验结果的准确性。
试剂与溶液
根据实验需求，准备适量的试剂和溶液，并确保它们的质量和纯 度符合要求。
实验操作流程
熟悉实验操作流程，确保每一步都按照规定的步骤进行，避免出 现操作失误。
样本处理
样本收集
按照规定的方法收集样本， 确保样本的代表性和可靠 性。
样本处理
对收集的样本进行适当的 处理，如离心、过滤、纯 化等，以获得可用于含量 测定的多肽药物。
样本保存
确保样本在保存过程中不 受污染和降解，以保证含 量测定的准确性。
数据分析
数据处理
对实验数据进行适当的处理，如数据清洗、异常 值处理等，以确保数据的质量和可靠性。
数据分析方法
选择合适的数据分析方法，如回归分析、方差分 析等，以得出准确的结论。
总结
灵敏度是选择含量测定方法的重要考虑因素之一，高灵敏度的方法能够提高实验 的准确性和可靠性，有助于推动多肽药物的研发进程。
特异性
特异性
是指测定方法能够区分多肽药物和其 他类似物质的能力。特异性的方法能 够准确测定多肽药物，避免其他物质 的干扰，提高实验的准确性。
总结
特异性是多肽药物含量测定中不可或 缺的考虑因素之一，高特异性的方法 能够排除其他物质的干扰，提供更准 确的实验结果。
03 含量测定方法
化学分析法
高效液相色谱法（HPLC）
01
通过色谱柱将多肽药物与其他杂质分离，然后检测分离后的多
肽药物，以确定其含量。
毛细管电泳法（CE）
02
利用电场驱动带电分子在毛细管中迁移，通过检测迁移时间确
定多肽药物的含量。
氨基酸分析法
生物化学简明教程第四版课后习题
生物化学简明教程（第四版)课后习题————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:２蛋白质化学１.用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答:（1) N-末端测定法:常采用2,4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
①2,4―二硝基氟苯(DNＦＢ或FＤNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与2,4―二硝基氟苯(2,4―DNFB）反应(Sａngeｒ反应)，生成ＤNP―多肽或DNＰ―蛋白质。
由于ＤNＦB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为黄色DNＰ―氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。
②丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Ｃl)反应生成DＮＳ―多肽或DNS―蛋白质。
由于DＮS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNS―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质ＤNＳ―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。
③苯异硫氰酸脂(ＰITＣ或Edman降解)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯(PITＣ）反应(Eｄman反应),生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。
在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。
根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。
（2)Ｃ―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
②还原法:肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。
多肽含量的测定方法的比较
多肽含量的测定方法的比较Ξ刘 扬,张占雄(内蒙古农业大学生物工程学院,内蒙古呼和浩特 010018) 摘 要:多肽含量的测定方法与有些蛋白质含量的测定方法相同,但并非所有蛋白质含量的测定方法都适用于多肽的含量测定,本文介绍了几种常见的多肽含量测定的方法:①双缩脲法;②Fo lin—酚试剂法;③O PA法(邻苯二甲醛法);④紫外吸收法,并且进行了比较。
关键词:多肽;肽键;显色;紫外吸收 多肽是由蛋白质中20种天然氨基酸以不同组成和排列方式通过肽键(也称酰胺键)相互连接形成的化合物的总称[1],具有多种人体代谢和生理调节功能,如易消化吸收、促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用,随着人们对于多肽的深入研究,对于多肽含量测定的需要,本文着重介绍几种多肽含量测定的方法。
由于多肽的氨基酸数目以及种类与蛋白质有差异,那么不是所有能够测定蛋白质含量的方法都适合多肽。
因此选择了几种专门针对肽键作用的测定方法。
1 双缩脲法在强碱性溶液中,双缩脲与CuS O4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,于540nm处进行比色来测定蛋白质含量,此方法适用于多肽含量的测定[2]。
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
测定范围为1～10m g蛋白质。
测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10m g m l。
采用不同浓度的标准酪蛋白制作标准曲线。
2 O PA法(邻苯二甲醛法)[3,4]此方法适用于乳源性的多肽的测定,本实验的试剂是50m l,反应试剂:含有25m l100mM的硼砂2.5m l20%(w w)S D S、40m g O PA(邻苯二甲醛)溶于1m l甲醇、100ΛlΒ-巯基乙醇用去离子水定容至50m l,用不同浓度的胰蛋白酶水解的酪蛋胨(多肽)来制作标准曲线,50Λl样品溶液与2m l试剂室温下反应2m in,在340nm下比色,查标准曲线即可以得到多肽的含量。
利用乳酸乳球菌发酵大豆蛋白产低聚肽的研究
卢美欢，仝泽方，马英辉，等. 利用乳酸乳球菌发酵大豆蛋白产低聚肽的研究[J]. 食品工业科技，2024，45（5）：1−7. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030041LU Meihuan, TONG Zefang, MA Yinghui, et al. Production of Oligopeptide from Soybean Protein by Lactococcus lactis Fermentation[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(5): 1−7. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030041· 特邀主编专栏—食源性功能物质挖掘与评价（客座主编：王颖、郭慧媛） ·利用乳酸乳球菌发酵大豆蛋白产低聚肽的研究卢美欢，仝泽方，马英辉，张美丽，李利军*（陕西省微生物研究所，陕西西安 710043）摘 要：筛选可以发酵分解大豆蛋白的食源性微生物，对分解产生的多肽进行分子量分析，通过分离纯化获得低聚肽并研究其抗氧化活性。
结果表明：从自制泡菜中分离到一株食源性乳酸菌PZ1，经形态和16S rDNA 鉴定为乳酸乳球菌；全基因组分析PZ1菌株具有多种肽酶和蛋白酶基因，具备分解蛋白的潜在能力；利用PZ1发酵大豆分离蛋白，采用凝胶渗透色谱分析发酵产生的多肽，分子量1000 Da 以下占比达85%；通过超滤纯化获得300~1000 Da 的低聚肽；研究大豆低聚肽的抗氧化活性，发现低聚肽对DPPH 自由基、羟基自由基（·OH ）和超氧阴离子自由基（O 2−·）均有较好的清除作用，浓度为2 mg/mL 时，清除率分别为79.31%、78.27%和84.62%。
酵母水解物中小肽的测定方法及意义
酵母水解物中小肽的测定方法及意义酵母中含有三类大分子：蛋白质、核酸和多糖，其中蛋白质几乎占了干物质一半以上的含量，必需氨基酸充足，呈味氨基酸丰富，总谷氨酸含量在6%以上，色氨酸在1%以上，所以酵母水解物诱食性绝佳。
新鲜酵母中的蛋白质经水解后产生的肽类物质，曾引起专家和配方师们的广泛关注与讨论，那么酵母水解物中的小肽具体含量应该是多少?是否可以精确、重复检测?以下内容是由湖北海宜为大家整理的小肽的定义及检测方法：一、什么是小肽?肽是蛋白质降解为游离氨基酸过程中的中间产物，通常将大于20个的氨基酸残基构成的肽称为多肽(Poly-peptide)，2-20个氨基酸残基构成的肽称为寡肽(Oligopeptide)，而将仅由2个或3个氨基酸残基构成的二肽和三肽称之为小肽(Small peptide)。
(参考《动物营养学》第三版)二、小肽含量的检测方法：1、大豆肽粉，国标：GB/T 22492-2008原理：采用高效凝胶过滤色谱法测定。
即以多孔性填料为固定相，依据样品组分相对分子质量大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱法测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到大豆肽的相对分子质量大小及分布范围。
本法适用于以大豆粕或大豆蛋白等为原料，用酶解或微生物发酵法生产的，相对分子质量在5000以下，主要成分为肽的粉末状物质。
2、海洋鱼低聚肽粉，中国轻工行业标准：QB/T 2879-20072.1 低聚肽方法原理：低分子量的蛋白质水解物(包含低聚肽及游离氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液;高分子质量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。
样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质，收集离心清液。
按照GB/T5009.5规定的方法测定离心清液的酸溶蛋白质水解物含量，清液的酸溶蛋白质水解物含量减去游离氨基酸含量即得到低聚肽的含量。
该法仅可以粗略测出样品中的三氯乙酸可溶性氮，并且不能扣除核酸中的含氮碱基对检测结果的干扰，更加不能精确检测二肽、三肽具体含量是多少。
多肽药物的含量测定方法
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效价单位定义 能抑制一个胰蛋白酶单位[每秒钟能水解1μmol的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为一个胰蛋 白酶单位（microkatal）]的活力称为一个抑肽酶活力单位（EPU）。每1EPU的抑肽酶相当于 1800KIU。
注意事项：
（1）本实验测定原理：在一定条件下（pH8.0，25℃），胰蛋白酶可使N-苯 甲酰-L-精氨酸乙酯水解为N-苯甲酰-L-精氨酸，使溶液pH下降，当加入氢氧化 钠滴定后，使溶液pH又回到8.0，水解继续进行。
准品对微生物产生抑菌圈面积的大小，从而得到待测样品相对与标 准品的效价
实例（3）缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通
过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品的 效价。
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总结：
在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式： 第一种属于比较精准的定量——如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多
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(4) 测定法
取硼砂－氯化钙缓冲液（pH 8.0）9.0ml与底物溶液1.0ml，置25ml烧杯中，于25℃±0.5℃恒温水浴中 放置3～5分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH值为8.0，精密加入供试品溶液 （经25℃保温3～5分钟）1ml，并立即计时，用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定 释放出的酸，使溶液的pH值始终保持在7.9～8.1。每隔60秒读取pH值恰为8.0时所消耗的氢氧化钠滴 定液（0.1mol/L）的体积（ml），共6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液1ml，按上法操作，作为 对照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）为纵坐标作图，应为一 条直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积 （ml），按下式计算。
效价单位定义 能抑制一个胰蛋白酶单位[每秒钟能水解1μmol的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为一个胰蛋 白酶单位（microkatal）]的活力称为一个抑肽酶活力单位（EPU）。每1EPU的抑肽酶相当于 1800KIU。
注意事项：
（1）本实验测定原理：在一定条件下（pH8.0，25℃），胰蛋白酶可使N-苯 甲酰-L-精氨酸乙酯水解为N-苯甲酰-L-精氨酸，使溶液pH下降，当加入氢氧化 钠滴定后，使溶液pH又回到8.0，水解继续进行。
准品对微生物产生抑菌圈面积的大小，从而得到待测样品相对与标 准品的效价
实例（3）缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通
过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品的 效价。
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总结：
在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式： 第一种属于比较精准的定量——如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多
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(4) 测定法
取硼砂－氯化钙缓冲液（pH 8.0）9.0ml与底物溶液1.0ml，置25ml烧杯中，于25℃±0.5℃恒温水浴中 放置3～5分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH值为8.0，精密加入供试品溶液 （经25℃保温3～5分钟）1ml，并立即计时，用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定 释放出的酸，使溶液的pH值始终保持在7.9～8.1。每隔60秒读取pH值恰为8.0时所消耗的氢氧化钠滴 定液（0.1mol/L）的体积（ml），共6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液1ml，按上法操作，作为 对照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）为纵坐标作图，应为一 条直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积 （ml），按下式计算。
多肽含量的测定
多肽含量的测定一．双缩脲法1. 标准曲线的制作取十个10ml 的容量瓶，用5% 的TCA 依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 和1.8mg/ml 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液，然后分别取6.0ml 标准溶液，加入4.0ml 双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min 离心10min，取上清液于540nm 下测定OD 值(以第一管做空白对照)。
以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD 值为纵坐标Y，制作标准曲线。
2.多肽含量的测定多肽含量的测定程序：取 2. 5ml 样品溶液，加入 2.5ml 10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r /min 下离心15min，将上清液全部转移到50ml 容量瓶中，并用5%的TCA 定容至刻度，摇匀。
然后取6.0ml 上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂=3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min 离心10min，取上清液于540nm 下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，进而可求得样品中多肽含量。
所需试剂：大豆蛋白、木瓜蛋白酶、三氯乙酸、Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液、氢氧化钠、硫酸铜双缩脲配制方法：先将双缩脲试剂A加入组织样液，振荡均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂B，振荡均匀。
双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液；双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。
二．肽键测定法1.标准曲线绘制用标准多肽溶液溶液配制一系列50～500ug/ml 已知浓度的5. 0m l 蛋白质溶液, 测定238nm 的光吸收值A 238, 以A 238 为纵坐标, 蛋白质含量为横坐标, 绘制出标准曲线。
我国近年来生物化学研究热点
信息资源管理上机报告我国近年来生物化学研究热点：基于共词分析视角班级：管信1002班学号：201003083姓名：王秀玉目录目录 11 实验内容 2（1）文献资源检索 2（2）文献挖掘 2（3）分析当前国内生物化学领域研究热点、推测研究趋势 22 文献获取 23 关键词确定 34 其他基本信息 5（1）发表单位信息 5（2）作者信息 5（3）热门文章 65建立供词相关矩阵、相似矩阵、相异矩阵 7 （1）共词矩阵 7（2）相似矩阵 8（3）相异矩阵 86 聚类分析 97 因子分析 108 结果分析 14（1）牛血清蛋白研究 14（2）热休克蛋白研究 14（3）对多糖的研究 14（4）PCR 15（5）生物信息学 15（6）蛋白质组 15（7）代谢组学 15(8) 基本特性 159 总结 1610 个人体会 161 实验内容本实验是研究国内生物化学领域的研究状况和特点，通过现阶段的热点的分析，进而推测该领域在将来一段时间内的研究趋势。
研究过程主要分为以下三个步骤。
（1）文献资源检索最初对各种数据库以及搜索引擎进行初步尝试和了解，选择资料翔实全面、检索查询较为方便和精细的数据库进行文献资源的检索。
最终选择了中国学术期刊网（中国知网）。
其数据资料全面、查询方法多样且得到的结果比较精确，符合本次实验的要求，能够得到所需要的数据和文献全文。
（2）文献挖掘首先对各种文献挖掘方法进行学习和掌握，特别是书中介绍的共词分析和共引分析，了解每种方法的特点与用途。
之后确定自己所要研究的领域以及研究的方向和想要得到结果。
接下来比较需要的结果和已掌握的方法，最终决定所需要使用的方法。
确定的研究领域为生物化学，需要研究出近十年该领域的研究热点并进行适当的研究方向的预测。
最终选择了共词分析的方法作为该实验文献挖掘的方法。
（3）分析当前国内生物化学领域研究热点、推测研究趋势2 文献获取为了探索国内生物化学领域的研究状况和特点，本实验选择中国学术期刊网(CNKI)全文数据库获取文献。
棉籽蛋白水解物水解度3种测定方法的比较
棉籽蛋白水解物水解度3种测定方法的比较林虬;黄薇;宋永康;姚清华;颜孙安;钱爱萍【摘要】介绍了一种比较简单可行、适用于棉籽蛋白水解度的测定方法——OPA 法.选用中性蛋白酶将棉籽蛋白水解成棉籽多肽,通过新建立的方法测定不同酶解时间棉籽蛋白水解液的水解度,并与文献所报道的甲醛滴定法和茚三酮比色法进行比较.结果表明,与甲醛滴定法和茚三酮比色法相比,OPA法更简便、更快速,且灵敏度高、可重复性强、对环境友好,是3种方法中最适合测定棉籽蛋白水解液水解度的方法,同时该方法也适用于饲料及食品行业中其他蛋白水解度的测定.%This paper introduced a method that based on the reaction oi primary ammo groups with o-phthaldialdehyde (OPA) for determining the hydrolytic degree of cottonseed protein. Neutral protease was used to hydrolyze cottonseed protein and the degree of hydrolysis (DH) was compared with three assay methods, I. E. O-phthaldialdehyde method, formaldehyde titration method and ninhydrin colorimetric method. Comparing with formaldehyde titration and ninhydrin colorimetric methods, results showed that OPA method performed more accurate and faster in analyzing, easier to handle, repeatable in results and friendly for environment. It is recommended that OPA method is an appropriate method for evaluating in hydrolytic degree of cottonseed protein.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】5页(P1076-1080)【关键词】水解度;棉籽蛋白;对苯二甲醛法【作者】林虬;黄薇;宋永康;姚清华;颜孙安;钱爱萍【作者单位】福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州350003【正文语种】中文近年来，棉籽蛋白受到饲料业的普遍关注，提高棉籽蛋白资源利用率成为当前国内外学者研究的热点，其中使用蛋白酶生物技术将低值的蛋白源转化成多肽、寡肽等高值蛋白原料的方法极具生命力，是目前棉籽蛋白质的开发和利用的新方法和思路。
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169※分析检验食品科学2005, Vol. 26, No. 7蛋白水解液中多肽含量的测定方法鲁伟1，任国谱2，宋俊梅1(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南， 250100；2.湖南亚华乳业博士后工作站，湖南长沙， 410116)摘 要：用10%(W/V)的三氯乙酸沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm下测定其OD值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。
关键词：双缩脲反应；三氯乙酸；多肽含量Determination of Content of Peptides in Protein HydrolysatesLU Wei1，REN Guo-pu2，SONG Jun-mei1(1.College of Food and Bioengineering, Shandong Institute of Light Industry, Jinan 250100,China;2.Hunan Yahua Corp. Ltd.& East China Normal University，Changsha 410116,China)Abstract：Macromolecule protein in protein hydrolysate was deposited by using 10% trichloroacetic acid. After centrifugal-ization and filtration, biuret reagent was added to the clear solution. The OD value was mensurated under 540nm. Then the content of peptides of the sample was obtained through contrasted on the standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg tetrapeptide.Key words：biuret reaction；trichloroacetic acid；content of peptides中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2005)07-0169-03收稿日期：2004-06-02作者简介：鲁伟(1979-)，男，硕士研究生，研究方向为微生物酶技术。
(12): 799-809.[5]George J C, Buckwallter K A, Cohen M D, et al. Langerhanscell histiocytosis of bone: MR imaging[J]. Pediat Radio, 1994, 34(1): 29-32.[6]Francesco Cubadda, Marcelo Enrique. ContiSize-dependentconcentrations of trace metals in four Mediterranean gastropods[J]. Chemosphere, 2001, 45(11): 561-569.[7]生活饮用水卫生标准[S].中华人民共和国卫生部发布GB5749-85.[8]国家质量检验检疫总局. 中华人民共和国国家标准GB184064-2001.农产品安全质量;无公害水产品安全要求[S]北京:中国标准出版社.蛋白质是人体必不可少的营养素之一，但不同蛋白质由于其氨基酸组成和空间结构不同，在人体内的消化吸收率也大不相同[1]。
将蛋白质水解为多肽，可以大大提高其消化吸收率。
近代研究表明，蛋白质在体内消化后并不完全以氨基酸的形式吸收，而大都是以寡肽的形式吸收[2]。
因此，水解蛋白质生产多肽产品正成为当今研究的热门课题之一。
在水解蛋白质的过程中，控制蛋白质的水解程度，尽可能少的产生氨基酸，尽可能多的得到目标产物多肽，是水解的根本目的。
这就要求建立一种能快速测定水解液中多肽含量的有效方法。
对蛋白质水解程度的测定有多种方法，三氯乙酸法[3]是其中常用的一种，它是利用三氯乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白质，继而以微量凯氏定氮法测定上清液中可溶性氮的含量，然后减去水解之前样品溶液中可溶性氮的含量，再与样品中的总氮量相比，从而确定其水解程度。
此法中微量凯氏定氮法测定的是水解液中可溶性总氮的含量，若改用双缩脲法[4]，便可测定其中含二个(包括二个)以上肽键的多肽的含量[4～6]。
本文利用10%的三氯乙酸沉淀样品水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm测定其OD值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。
从而建立了一2005, V ol. 26, No. 7食品科学※分析检验种快速测定蛋白水解液中多肽含量的有效方法。
１材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂(1) Gly-Gly-Tyr-Arg，Sigma公司。
(2) CuSO4・5H2O；NaOH；氨水；三氯乙酸，分析纯。
(3) 胰蛋白酶，杭州三叶生物化工厂2000U/g。
(4) Protamex， Novozyme，1.5AU/g。
1.1.2主要仪器和设备(1) 紫外可见分光光度计，UV-9100型，北京瑞利分析仪器公司。
(2) 低速离心机，LD5-2A型，北京医用离心机厂(3) 超级恒温水浴锅，BO220型，上海实验仪器厂有限公司。
(4) 电子分析天平，AL204型；PH计，DELTA 320型，METTLER TOLEDO公司。
1.2方法多肽含量的测定程序：取2.5m l样品溶液，加入2.5ml 10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10m in，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50m l容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，摇匀。
然后取6.0m l上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0m l(样液:双缩脲试剂=3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10m in，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，进而可求得样品中多肽含量。
２结果与讨论2.1标准曲线的制作取十个10ml的容量瓶，用5%的TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8m g/ ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0ml 标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/m in离心10m in，取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)。
以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线(图1)，得到回归方程y=0.3681x+0.0013，R2=1。
2.2沉淀反应的温度和时间对测定结果的影响称取30.00g全脂奶粉，溶于200m l蒸馏水中，加入胰酶0.6000g(E/S=2%，W/W)，于温度38℃，pH8. 5(以30%NaOH溶液维持pH)的条件下进行水解。
水解30min后，立即将水解液于90℃灭酶处理10min，然后图１ Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线Fig.1 Standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg反应温度(℃)60708090100室温OD值0.4500.4490.4460.4400.4450.442表１ 反应温度对测定结果的影响Table 1 Influence of reaction temperature on OD反应时间(min)0306090120150 OD0.4430.4420.4420.4420.4410.441表２ 反应时间对测定结果的影响Table 2 Influence of reaction time on determine results测定值(mg/ml)理论值(mg/ml)回收率(%) Gly-Gly-Tyr-Arg 3.98±0.03 4.099.5±0.75 Gly-Gly-Tyr-Arg+全脂奶粉 3.75±0.05 4.093.8±1.3表３ 标准肽的回收率Table 3 Yield of standard peptide冷却至室温，冷藏保存备用。
准确量取50.0ml水解液，于250ml容量瓶中定容。
2.2.1反应温度的影响取六支试管，于每一支试管中均加入4.0ml上述溶液，再加入4.0ml 10%的TCA。
将1-5号试管分别于60、70、80、90和100℃加热处理15min，0号试管不进行加热处理，于室温下放置15m in，继而按标准程序测定O D值，平行测定一次，实验结果见表1。
由上表可以看出，虽然经过不同温度处理，但各组所测得的OD值大体一致，也就是说，反应温度对测定结果的影响不是很明显，故不进行加热处理，而让其在室温下反应。
2.2.2反应时间的影响取六支试管，分别加入上述溶液4.0ml，10%的TCA 溶液4.0m l，于振荡器上混合均匀，分别于室温下放置0、30、60、90、120和150m i n，继而按标准程序测定O D值，平行测定一次，结果见表2。
由上表可以看出，反应时间对测定结果几乎没有影响，这就是说TC A能迅速使蛋白质沉淀下来，反应速度很快。
故在混合均匀后即可进行下面的实验，而无需等待。
2.3回收率实验配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽水溶液，按标准程序测定其中多肽含量。
实验重复6次，结果见表171※分析检验食品科学2005, Vol. 26, No. 73，与理论值几乎完全吻合，回收率为99.5%±0.75%。
用10%的全脂奶粉水溶液配制4.0mg/ml 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽溶液，按标准程序测定其中多肽含量。
实验重复六次，结果见表3，回收率为93.8%±1.3%。
全脂奶粉中的矿物质影响体系的OD 值，这在后续试验中将有所涉及。
2.4精密度测试配制4.0mg/ml 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽水溶液，按相同程序进行6轮平行测定，以检验测定程序的精密度，结果见表4。
样品脱脂全脂大豆分脱脂大豆大豆奶粉奶粉离蛋白蛋白粉肽样OD 值-0.060-0.0600.0800.0480.446表５ 全脂奶粉、大豆蛋白粉和大豆肽样中的多肽含量Table 5 Peptides content of whole milk powder, soybean proteinpowder and soy bean peptides 精密度S w =(∑S i 2/n)1/2为0.0479(n 为测定轮数)，标准偏差Cv=[(S w /x)×100](x 为测定平均值)为1.2%，平均值为3.99mg/ml 。