实验九细菌的生化鉴定
一、实验目的
1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；
2、掌握糖发酵试验、淀粉实验、吲哚实验、M.R.及V. P的原理、方法及相应培养基的制备方法。
3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
4、掌握以上实验的用途。
二、实验原理
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物特性，这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统，故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同，细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应，其在菌株的分类鉴定中具有主要意义。
1、糖发酵实验
不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加
入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。发酵后产生的有机酸：乳酸、醋酸、丙酸等（溴甲酚紫变色范围pH5.2~6.8, pH<5.2黄色，pH>6.8紫色）；发酵后产生的气体：甲烷、氢、二氧化碳等（杜氏小管内有气泡，产气漂浮）。
2、M.R.及V.P实验
很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）-pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色变为红色。VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸经缩合、脱羧后生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。
3、吲哚实验
吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
4、淀粉水解实验
微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解成小分子物质才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小的化合物，使其能被运输到细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程可以通过观察细菌菌落周围物质的变化来证实。如可以用滴加碘液到菌落周围看是否变蓝色来检查是否产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸会使培养基pH下降，可以在培养基中事先加入中性红试剂，培养基会从淡红色变为深红色。
5、触酶实验
触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。6、三糖铁实验（硫化氢产生实验）
某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。细菌能发酵乳糖和蔗糖产酸或产酸产气（变黄）。
三、实验仪器、材料和用具
1、实验仪器：37℃恒温培养箱。
2、微生物材料：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌种平板各1个。
3、试剂：40％NaOH溶液、乙醚、甲基红试剂、50g/L α－萘酚(95％
乙醇溶液)、30%双氧水和1%溴麝香草酚蓝酒精液。
4、用具：接种环、酒精灯、镊子、试管和杜氏小套管
5、培养基及其配方：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖和山梨醇）和三糖铁培养基。
（1）淀粉培养基100ml（分装于四个三角瓶，包扎，121~126℃灭菌20min）：蛋白胨，2g ；可溶性淀粉，0.4g；氯化钠，1g ；琼脂，3~4g；酵母提取物，1g；加单蒸水定容至100ml ，调整pH 为7.2。
（2）糖发酵培养基：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）：蛋白胨2g; 氯化钠，1g；葡萄糖，1g；加单蒸水定容100ml；pH调整为为7.4。溴甲酚紫溶液（1.6%水溶液）1ml
（3）M.R.及V.P实验培养基（葡萄糖胰蛋白胨水培养基）：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）：蛋白胨0.5g; K2HPO4，0.5g；葡萄糖，0.5g；加单蒸水定容100ml；pH调整为为7.4。
甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml 95％酒精中，再加入蒸馏水200ml。
（4）吲哚培养基（胰蛋白胨水培养基）：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）
蛋白胨1g；氯化钠，0.5g；加单蒸水定容100ml。
（5）三糖铁琼脂培养基（成品）：按培养基配方加。
具体配方（实验报告可以不抄）：蛋白胨20.0g；牛肉膏 3.0g；乳糖10.0g；蔗糖10.0g；葡萄糖 1.0g ；硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.5g；酚红0.025g或5g/L溶液5mL；氯化钠5.0g ；硫代硫酸钠
0.5g；琼脂12.0g；蒸馏水1000.0mL
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.4±0.1。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置10min，加热煮沸至完全溶解。
将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装试管(12mm×100mm)，每管约2～4mL，高压灭菌105℃ 20min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。
四、实验原理与步骤
1. 糖发酵实验
①试管标记：取分别装有不同糖类（如葡萄糖、蔗糖和乳糖等）发酵培养液的试管，根据需要培养的细菌做好标记（如大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照）。
②接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h和72h观察结果。
③观察记录：培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
2. V.P.试验
