脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

复里　

Ｕｎ提

ｉｖ（医学版

Ｓｅ）

ｉＦｕｄａｎ　Ｕｎｉｖ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｓｅ　２。。８　ｗｌｖｉａｙ，３５（３）　ｕｕｏ　’ｊ　ｊ　４５３　

不同基因载体系统对脐带血间充质　

干细胞转染效果的初步研究　

马晓生　吕飞舟地姜建元　李小康　

（　复旦大学附属华山医院骨科上海２０００４０；　日本国立成育医疗中心研究所移植免疫研究室　日本东京１５７—８５３５）　

【摘要】　目的　比较慢病毒载体和腺病毒载体转染人脐带血间充质干细胞后，外源基因的表达。方法采用人　

脐带血分离培养间充质干细胞，制备表达ＧＦＰ的慢病毒载体和腺病毒载体，用以转染间充质干细胞，观察其外　

源基因的表达。结果脐带血间充质干细胞与骨髓中的类似，其外表呈纤维样；转染５周后，慢病毒载体转染的　

ＧＦＰ阳性表达明显高于腺病毒载体。结论慢病毒载体较腺病毒载体作为基因转导系统更有优势。　

【关键词】脐带血；　间充质干细胞；　慢病毒载体；　腺病毒载体　

【中图分类号】Ｒ　３９２．１２　【文献标识码】Ｂ　

Ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ　

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　

ＭＡ　Ｘｉａｏ－ｓｈｅｎｇ　，ＬＵ　Ｆｅｉ—ｚｈｏｕ　，ＪＩＡＮＧ　Ｊｉａｎ－ｙｕａｎ　，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｋａｎｇ２　

（　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｈｕａｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００４０，Ｃｈｉｎａ；　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｈｅｎｇｙｕ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ　１　５７—８５３５，Ｊａｐａｎ）　

人脐血间充质干细胞治疗肝纤维化的研究进展

【中图分类号】r329 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）13-0068-02

研究发现，具多向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem

cells，mscs）， 脐带间充质干细胞具有无限增殖和多项分化潜能，

可以向肝细胞分化， 能在体外自我增殖， 并可以定向分化为内、中、外3 个胚层来源的多种细胞， 如骨、软骨、脂肪、神经及类肝细胞等， 有望用于肝脏疾病的治疗。脐带来源广泛，无伦理道德方面的争议。如果能够利用易于获得的mscs在体内外定向分化为肝前体细胞，则可做为肝细胞移植的一个主要来源。不过脐血中的间充质干细胞含量很少， 如何分离纯化？如何使其较长时间保持干细胞特性？ 如何诱导其向肝细胞分化？ 据研究表明，人脐血间充质干细胞能够贴壁生长， 而体外培养的贴壁细胞是一个异质细胞群， 可能含有多种细胞成分。一般呈现类纤维细胞形态，并可分裂增生， 且同时具有间皮细胞标志的贴壁细胞， 如cd44+ 细胞， 可以初步判断为是mscs。之前，报道hucmscs可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得， 并可冷冻保存； 复苏后在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4 的联合诱导下， 能定向分化为表达ck8&18， 并合成白蛋白和糖原的类肝细胞， 类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用。脐血中存在mscs， ucbmsc 形态与mscs相似，倍增时间为48 h ， 传代后形态基本无变化； ucbms c 不表达cd34及cd45， 强表达cd44

及cd166 ， 与mscs的表面抗原特性一致， 是脐血中区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干祖细胞。本研究先通过对hucmscs 的体外培养，对hucmscs进行纯化、扩增和鉴定；初步掌握hucmscs分离、培养及冻存的技术和方法，探索有效诱导hucmscs分化为肝前体细胞的途径；然后，将诱导和未诱导的hucmscs在体外与人肝星状细胞（hsc）共培养，为下一步研究其在体内通过不同途径移植到肝纤维化鼠体内，以观察其对肝功能的修复情况及对肝纤维化进程的影响奠定基础。

血细胞分离培养方法和步骤-2

收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。

此法分离获得淋巴细胞纯度高。

分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll来调整。

（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：

从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常用到的。方法如下。

无菌取上述淋巴器官，若为扁桃体，应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后，在含高浓度抗生素的洗液中4℃浸泡2-4h，以防污染。

将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤碎块，或在金属丝网上研磨，用洗液冲洗，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液。

自然下沉10min后，吸取上层细胞悬液，弃去下层沉淀的组织块，1500r/min离心，取沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗2次后，混悬于培养基中，分瓶培养。

用上述分离法所获得的拎包细胞，可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时可用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)、Tδ细胞等，供细胞移植用。 （三）人脐带血细胞分离培养：

人脐带血来源方便，采集容易，对母婴均无伤害。近年来研究表明，脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力的功能，是造血生长因子的重要来源。

脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞，其中CFU-G、BFU-E、CFU-GM近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/祖细胞，比骨髓更原始，具有很强的自我复制和再植能力。脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞，对骨髓造血具有支持作用，在体外培养扩增中具有更大的增值能力，是造血干细胞的理想来源，已被应用于Fanconi贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗，并容易获得骨髓造血功能的重建。

１１８８　新疆医科大学学报ＪＯＵＲＮＡＩ　ＯＦ　ＸＩＮＪＩＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　２０１０　Ｏｃｔ．，３３（１０）　

“三阶段法＂分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞　

张东辉　，许永华　，许　琴　，李建瑛　，是文辉　，李佳佳　，卢开伯　，　

邢彦超　，于良宽。，龙志新　

（　兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物科，。输血科，。妇产科；　新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐８３００００）　

摘要：目的　探讨运用“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血问充质干细胞的效果。方法　取人脐带血４份，经　

过３个阶段（去除红细胞阶段、短暂培养阶段、持续培养阶段），以完全低糖ＤＭＥＭ（含２Ｏ　胎牛血清）为培养基，纯　

化分离人脐血问充质干细胞。传代至第３代通过流式细胞仪和间充质干细胞诱导分化为成骨细胞进行鉴定。结　

果　４份人脐血中３份分离出间充质干细胞。分离培养的细胞经流式细胞仪检测不表达造血细胞的抗原　

（ＣＤ３４），表达间充质干细胞的抗原（ＣＤ２９　、ＣＤ４４　、ＣＤ１０５　），并能向成骨细胞方向分化。结抡“三阶段法”　能够简便、有效地从人脐血中分离出间充质干细胞。　关键词：人脐静脉血；间充质干细胞；体外培养　中图分类号：Ｒ４４６；Ｒ３４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—５５５ｌ（２０１０）１０—１１８８—０３　

Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＭＳＣｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｐｈａｓｅ　ａｐｐｒｏａｃｈ　

ＺＨＡＮＧ　Ｄｏｎ－ｇｈｕｉ，ＸＵ　Ｙｏｎｇ－ｈｕａ，ＸＵ　Ｑｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ　

（Ｄｅｐａｒｔｍａｎｔ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｕｒｕｍｑｉ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｃｏｍｍａｎｄ，　

＿ＰＬＡ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｉｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａ１　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＭＳＣｓ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）