生物技术制药
第一章绪论
★生物技术与生物技术药物的概念
生物技术药物的分类
✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)
✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物
✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物
★生物技术药物的特性
✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差
✦药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性
✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染
✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)
第二章基因工程制药
蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性
临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学
真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响
基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH
基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性
基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t
)
1/2基因工程制药基本环节
♦上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞
♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装
基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞
酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端
1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量
影响限制性内切酶反应的因素：
♦DNA样品的纯度：
♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。
♦酶切反应的温度
♦DNA的分子结构
♦反应缓冲液组成
♦反应时间、反应体积等
工具酶
✦核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。
•同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端
•同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端
DNA甲基化酶：具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解
✦DNA连接酶
•T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段
•大肠杆菌DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA 片段
✦聚合酶：以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3’-OH末端，合成方向为5’→3’。DNA聚合
酶、RNA聚合酶
•大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’DNA外切酶活性；3’→5’DNA外切酶活性；RNA H酶活性
•Klenow酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性
•T4噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA
•T7噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性
•Taq DNA聚合酶
•反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性
•末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP沿5’→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；不需要模板 载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载
外源DNA导入宿主细胞的能力。
✦质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA)；线状DNA(lDNA)•质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性
•用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点
•常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体
✦λ噬菌体载体：插入型载体、臵换载体
•来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。
目的基因的常用制备方法
✦化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
✦PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
✦基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离
✦cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难
第一链：mRNA模板，引物(polyT) ，逆转录酶，dNTPs
第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；
S1内切酶)
引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，
dNTPs)
♦基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln(1–f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小♦双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性
♦影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
重组DNA导入宿主细胞
✦导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法
