血液凝固和影响血液凝固的因素
一、实验目的
通过测定某些条件下的血液凝固时间，加深理解影响血液凝固的因素。
二、实验仪器与材料
家兔；石蜡油，冰块，肝素，草酸钾溶液，肺组织浸液（取兔肺剪碎，洗净血液，浸泡于3～4倍量的生理盐水中过夜，过滤收集的滤液即成肺组织浸液，存冰箱中备用）。氯化钙，氨基甲酸乙酯，生理盐水；兔手术台，常规手术器械，注射器，小烧杯，试管架，试管，动脉夹，动脉插管，恒温水浴槽，秒表，竹签。
三、实验方法与步骤
１、麻醉固定
家兔称重后，按1g/kg 体重剂量耳缘静脉注射200g/L 氨基甲酸乙酯。待兔麻醉后，将其仰卧，先后固定四肢及兔头。
2、颈部手术
剪去颈前被毛，颈前正中切开皮肤６～７cm,直至下颌角上1.5cm,用止血钳钝性分离软组织及颈部肌肉，暴露左、右颈总动脉鞘。用玻璃分针分离出两侧动脉鞘内颈总动脉，在一侧颈总动脉远心端结扎，近心端用动脉夹夹住，并在动脉下面预先穿一细线备用。用眼科剪在靠近结扎处动脉壁上剪一“V ”字形切口，将动脉插管向心方向插入颈总动脉内，结扎导管以备取血。
3、取8支试管，按下表准备不同的实验条件
表1-1 促凝和抗凝试验
4、取血
开动脉夹，每管加入血液2 ml 。将多余的血盛于小烧杯中约20ml ，并不断用竹签搅动。 试管
编号 实验条件 凝血时间
每管加2ml 1 对照管（无添加） 2 放棉花少许 3 石蜡油涂管内壁 4
肝素1ml 5
草酸钾0.1ml 6
肺组织0.1ml 7
生理盐水2ml 8 冰块
小烧杯放血20ml
放血时用竹签不
断搅动，2~3分钟
后用水冲洗竹签
后观察
5、记录凝血时间
每个试管加血2 ml后，即刻开始计时，每隔壁15 s 倾斜一次，观察血液是否凝固，至血液成为凝胶状不再流动为止，记录所经历的时间。4、5、6号试管加入血液后，用拇指盖住试管口将试管颠倒两次，使血液与药物混合。
四、实验结果
促凝和抗凝试验
试管编号实验条件凝血时间/min 平均值X 标准差S P值
1 对照、空管 5.5 5 5.75 5.417 0.382
2 棉花 4 4.25 3.5 3.917 0.382 0.037
3 肝素>60 >60 >60
4 石蜡>60 >60 >60
5 草酸钾>60 >60 >60
6 肺组织浸液0.25 1 0.5 0.583 0.312 0.004
7 生理盐水7.25 8 9.25 8.167 0.825 0.015
8 冰浴>60 >60 >60
五、实验讨论
血液凝固过程是由许多凝血因子参加的酶促反应。根据血液凝固过程中凝血酶原激活途径不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性凝血是指参与血液凝固的凝血因子全部存在于血浆中；外源性凝血是指在组织因子参与下的血凝过程。本实验采用动物颈动脉放血取血，血液几乎未与组织因子接触。因此，凝血过程主要是内源性凝血系统的作用。肺组织浸液中含丰富的组织因子，加入试管观察外源性凝血系统的作用。
血液凝固是指血液由流动的液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程。其实质就是血浆中的可溶性纤维蛋白转变成不可溶性的纤维蛋白的过程。纤维蛋白交织成网，把血细胞和血液的其他成分网罗在内，从而形成血凝块。血液凝固是一系列复杂的酶促反应过程，需要多种凝血因子的参与。
血浆与组织中直接参与血液凝固的物质，统称为凝血因子。目前已知的凝血因子主要有14种，即凝血因子Ⅰ～ⅩⅢ（简称FⅠ～FⅩⅢ）。此外还有前激肽释放酶、高分子激肽原等。在这些凝血因子中，除FⅣ是Ca2+外，其余的凝血因子均为蛋白质，而且FⅡ、FⅦ、F Ⅸ、FⅩ、FⅪ、FⅫ和前激肽释放酶都是丝氨酸蛋白酶，能对特定的肽链进行有限水解；但正常情况下这些蛋白酶是以无活性的酶原形式存在，必须通过其他酶的有限水解而暴露或形成活性中心后，才具有酶的活性，这一过程称为凝血因子的激活。
血液凝固是由凝血因子按一定顺序相继激活而生成的凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白的过程。因此，凝血过程可分为凝血酶原酶复合物（也称凝血酶原激活复合物）的形成、凝血酶的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。
凝血酶原复合物的形成凝血酶原复合物可通过内源性凝血途径和外源性凝血途径生成。两条途径的主要区别在于启动方式和参与的凝血因子有所不同。但两条途径中的某些凝血因子可以互相激活，故两者间相互密切联系，并不各自完全独立。
（1）内源性凝血途径：内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的异物表面（如玻璃、白陶土、硫酸酯、胶原等）接触而启动。当血液与带负电荷的异物表面接触时，首先是FⅫ结合到异物表面，并被激活为FⅫa。FⅫa的主要功能是激活FⅪ成为FⅪa，从而启动内源性凝血途径。
（2）外源性凝血途径：由来自于血液之外的组织因子暴露于血液而启动的凝血过程，成为外源性凝血途径，又称组织因子途径。组织因子是一种跨膜糖蛋白，存在于大多数组织细胞。在生理情况下，直接与循环血液接触的血细胞和内皮细胞不表达
组织因子，但约有0.5%的FⅦ处于活化状态（FⅦa）。当血管损伤时，暴露出组织因子，后者与FⅦa结合而形成FⅦa—组织因子复合物，后者在磷脂和Ca2+存在的情况下迅速激活FⅩ生成FⅩa。
由内源性和外源性凝血途径所生成的FⅩa，在Ca2+存在的情况下可与FVa在磷脂膜表面形成FXa—FVa—Ca2+—磷脂复合物，即凝血酶原复合物，进而激活凝血酶原。
凝血酶原的激活和纤维蛋白的生成凝血酶原在凝血酶原复合物的作用下激活成为凝血酶。
1、棉花给血液凝固提供了一个粗糙的表面，容易使血小板发生黏着、聚集，然后发生解体，释放许多凝血因子和血小板因子；另外棉花含许多带负电荷的植物纤维，也能激活凝血因子XⅡ，启动内源性凝血途径。因此放有棉花的试管血液凝固加快。
2、抗凝血酶Ⅲ和肝素是机体内重要的抗凝物质。抗凝血酶与凝血酶等多种凝血因子的活性中心——丝氨酸残基结合，是这些凝血因子的活性受到抑制或失活，从而达到抗凝的作用。肝素则主要通过与血浆中的的一些抗凝蛋白，如抗凝血酶Ⅲ结合，加强后者的抗凝作用。此外肝素还能使血管内壁细胞释放凝血抑制物和纤溶酶原激活物，增强纤溶作用。因此在试管内放入肝素时血液不会发生凝固。
3、由于石蜡油表面光滑，不易引起血小板黏着，即不易使血小板发挥促进凝血的作用。另外石蜡油为绝缘体，其把试管表面所带的负电荷覆盖，不利于凝血因子XⅡ的激活，因此血液凝固比放有棉花的试管慢，也比正常对照组慢。
4、凝血过程中Ca2﹢是重要的凝血因子，其参与了血液凝固的许多环节，当血液中没有Ca2﹢时血液就不会发生凝固。在试管中加入草酸钾之，由于草酸钾与Ca2﹢发生反应，生成草酸钙沉淀，是血液中没有Ca2﹢，故血液不会发生凝固。
5、肺组织浸出液中含有丰富的凝血因子Ⅲ，易通过外源性哪些途径迅速发生凝血反应，因此加肺组织浸出液的试管血液凝固发生最快。
6、加入生理盐水稀释了血液，使凝血酶的浓度降低，延长了血液凝固的时间。
7、血液凝固的过程由许多蛋白质酶的参与，所以当温度降低时，酶的活性减弱，因此放置于冰水中的试管血液长时间不凝固，此即低温影响了凝血酶的活性有关。
8、不管是内源性凝血还是外源性凝血，凝血的最后阶段都是在凝血酶的作用下，把那纤维蛋白原被水解成纤维蛋白，形成的纤维蛋白不断地交叉呈网状结构，把血液中所有的血细胞网络于其中，从而发生血液凝固。静止烧杯中发生了上述的凝血过程，所形成的纤维蛋白没有被破坏，所以杯中血液凝固。而用竹签搅拌血液的过程中，虽然也发生了凝血的过程，纤维蛋白原被水解成纤维蛋白，但形成的纤维蛋白被不断地缠绕到了竹签上，经水漂洗后，竹签上剩下的是白色丝状的纤维蛋白，又经搅拌后，杯内血液中的纤维蛋白原被全部耗尽，无法再形成纤维蛋白网罗血细胞，故血液不再发生凝固。
六、实验结论
加了肝素、草酸钾等抗凝剂的试管，在规定的时间内没有发生凝血现象。温度对血液凝固也有影响，放置于冰水中的试管血液凝固也明显减慢，在规定的时间内没有发生凝血现象。棉花和石蜡油是观察血液接触面的粗糙程度对血液凝固的影响，结果显示血液中有棉花使血液凝固时间明显并涂石蜡油润滑是试管壁的快。加肺组织浸液的试管血凝最快，加生理盐水的试管比正常血凝稍微加快，但差别不是很大。
此外，不断搅拌血液的竹签上有白色丝状物缠绕，且血液不发生凝固，对照组血液则正常凝固。
七、参考文献
[1]朱大年.生理学.第七版.北京:人民卫生出版社,2009,63-69
[2]陆源、林国华、杨午鸣.机能学实验教程.第二版.北京:科学出版社,2010
