光合细菌

食品乳酸菌鉴定方法的综述（生物工程学院，赵文良）【摘要】乳酸菌是食品发酵工业中一类重要的菌种, 准确快速的乳酸菌分类鉴定是十分必要的。

该文论述了食品中乳酸菌的分类和鉴定技术，着重阐述了乳酸菌表型特征鉴定以及分子鉴定技术。

本文对目前国内外的食品乳酸菌的鉴定做一综述。

【关键词】乳酸菌鉴定方法综述引言很久以前人们就知道乳酸发酵，早期的细菌学家将那些可以自发酸化传统乳酸发酵食品的细菌称之为“乳酸菌”。

乳酸菌指一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性杆菌或球菌,不形成芽抱、不运动、厌氧或兼性厌氧，不能还原硝酸盐的一类细菌的总称[1]。

乳酸菌是广义范畴的概念，是非正式、非规范的细菌分类学名称[2]。

乳酸菌广泛地存在于自然界、动植物体、乳制品和发酵食品中，且大多数为非致病菌，属于有益微生物，是人体正常菌群。

人们在生产和应用中要利用乳酸菌, 需要了解它们的生物学特性, 因此对乳酸菌进行快速、可靠的分类和鉴定在微生物学和食品科学的研究中是必需的。

1 乳酸菌乳酸菌是存在于人体内的益生菌，从形态上主要分为球状和杆状2大类。

按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种[3]。

目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。

乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。

双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。

[4]2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Strepto-coccus thermophilus)。

而国外用于酸奶及微生物制剂的主要乳酸菌种包括:L.acidophilus、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、罗氏乳杆菌(L.rogosae)、植物乳杆菌(L.plantarum)、L.casei、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、B.breve、B.longum、B.bifidum等。

近年来,随着乳酸菌众多有益功能的开发，如改善肠道菌群结构、抑制病原菌、降低胆固醇、提高机体免疫力、消除致癌因子等，发酵乳制品生产在我国发展很快,销售量逐年上升。

2 乳酸菌的鉴定2.1 表性特征鉴定人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有悠久的历史,并积累了丰富的经验和知识,形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法,包括形态和生理生化特征鉴定法、抗菌谱试验分类法、化学分类法、双歧杆菌的酶学鉴定法等,这种基于表面受体的特异性和生化特性的检测方法为表型特征鉴定法[5]。

由于该方法无法显示菌体基因组信息,不能体现鉴别菌株间的亲缘关系,且其方法自身检测的模糊性,分辨率不高,重复性差,且结果受微生物生长条件的影响等缺点,基于表型特征的培养鉴定方法无法对乳酸菌进行准确的属或者种甚至菌株水平的鉴定。

2.1.1形态和生理生化特征鉴定法该方法是实验室进行常规菌种鉴定中最常用和最关键的环节。

其中,细菌显微形态观察指标主要有革兰氏染色、细胞形态、运动性、是否有芽孢、鞭毛等。

在众多的细菌快速鉴定系统中,API系统是在世界范围内应用最广、种类最多的系统。

然而,许多乳酸菌仅凭形态和生化试验不能准确鉴定。

如双歧杆菌属的种间鉴别及双歧杆菌属与乳杆菌属的属间鉴别。

2.1.2抗菌谱试验分类法各种细菌对不同抗菌药物的敏感性不一,同一种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也常存有差异，在乳酸菌的鉴定中也是如此。

不同的乳酸菌都有其各自的抗菌谱,而对每一种抗生素,不同的乳酸菌会表现出不同的敏感度,从而做出判断。

2.1.3化学分类法乳酸菌的菌体组分或代谢产物在不同种属间存在差异,通过测定这些成分的含量,可以进行菌种鉴定。

如乳酸旋光性的测定、乳酸菌含有的醌分析等。

另外,在厌氧细菌和兼性厌氧细菌属、种的鉴定中,一个不可缺少的依据是糖类代谢的特异性终产物,如同型发酵的乳酸杆菌主要产乳酸；异型发酵的乳酸杆菌则产生等摩尔的乳酸、乙酸、CO2；双歧杆菌的代谢产物乙酸:乳酸的摩尔比为3:2及少量的甲酸和琥珀酸等。

目前应用于厌氧菌代谢产物的分析方法有不少，其中应用最广泛的是气、液相色谱法。

2.1.4双歧杆菌的酶学鉴定法双歧杆菌是目前较常用的益生菌之一,其特征性酶的识别对于属及种的鉴定具有重要意义[6]。

2.2分子生物学及基因水平的鉴定方法传统的表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力,培养条件的改变还可能导致结果发生改变,鉴定结果很不稳定。

因此,人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏的方法用于微生物的分类研究[7]。

从分子和基因水平来认识乳酸菌的遗传结构、组成和分类,许多新的分子标记技术被用来进行乳酸菌的分类和鉴定。

2.2.1 限制性片段长度多态性分析(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记[8]。

利用RFLP 进行乳酸菌鉴定时，常与荧光标记联合使用。

原理是检测DNA 扩增产物经限制性内切酶酶切后形成特定DNA 片段的大小，由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制性内切酶识别和酶切位点发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

采用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。

通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。

它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。

该技术用于乳酸菌菌株种内水平鉴定的DNA指纹法。

RFLP 方法结果稳定，适用于大批量样品的分类、鉴定研究。

2.2.2 随机扩增DNA多态性分析(random amplified poly-morphic DNA，RAPD)随机扩增多态性DNA也叫随机引物PCR(Arbitrarily Primed_PCR,AP_PCR)。

该方法的基本原理是:随机合成的长为10 bp左右的寡核苷酸引物,在较低的退火温度下结合到与之最同源的DNA序列上,引物之间的区域得到扩增,PCR产物经电泳后形成多态性可作为鉴定的依据。

RAPD的引物是随机合成的,但也有一定规律,即引物中G和C的含量很高。

RAPD 是利用一系列不同的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链作为引物，根据不同的基因组中与随机引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同，以及相对应的D N A 指纹图谱的不同，对所研究的乳酸菌进行分类鉴定。

RAPD 可对整个基因组进行多态性分析。

RAPD主要有两个优点:即分辨率高,不必知道基因组DNA的任何序列信息[9]。

缺点是重复性很差,反应条件稍有变化就会改变电泳图谱的多态性,而且RAPD技术很难将乳酸菌鉴定到种的水平，但可以和其他技术共同用于乳酸菌的鉴定。

2.2.3扩增片段长度多态性(Amplified FragmentLength Polymorphism,AFLP)AFLP是RFLP与PCR相结合的产物,扩增片段长度多态性(AFLP)是一种常用的分子标记技术,它是从RAPD和RFLP技术的基础上发展而来[10]。

其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段,再使双链人工接头的酶切片段相边接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。

AFLP技术的重复性好,多态性高,被广泛地用于细菌、真菌和植物的分类和鉴定。

它结合了RFLP和RAPD两种技术的优点,具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点，但AFLP 技术操作水平要求较高,设备条件要求较高。

2.2.4变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)和温度梯度凝胶电泳(temperaturegradient gel electrophoresis，TGGE)DGGE/TGGE 是适合于研究复杂环境群体微生物的方法, 可以针对优势或重要种属研究复杂微生物群落结构及微生物多样性[11]。

该方法是可以选择性地针对微生物群落中的某一类细菌进行特异性PCR扩增,再将扩增产物在TGGE/DGGE胶上分离并解析该类群中的细菌组成, 能够提供有关群体变化和差异的信息。

DGGE/ TGGE 带谱中每条带可能代表一个不同的微生物物种,电泳带谱中条带的数量反映环境微生物菌落中优势类群的数量。

为了得到更详细的信息,往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂交或建立细菌16S rDNA 文库或将条带切割下来重新扩增后进行测序, 从而进行系统发生发育分析。

DGGE/TGGE 在检测和鉴定人类胃肠道内分支杆菌属和乳酸杆菌属等菌群时是一种非常有效的技术,并可用以监测患者在应用抗生素后胃肠道菌群的改变。

DGGE 和TGGE 方法可对等长的DNA 序列进行进一步的分离，或对大量的样本进行筛选检测。

该方法省时、省力、操作简单易行、灵敏度高，可检测到一个核苷酸水平的差异。

2.2.5电泳核型标记技术（EK）生物体的染色体条数及其大小代表着一个生物所含有的遗传物质的多少与其组织形态，此被称为核型（karyotype）的特征随物种的分化而改变，因此具有特定的系统分类学意义，电泳核型（electrophoretic karyotype）即利用脉冲电泳技术获得的显示真菌完整染色体DNA 数目与各完整染色体DNA分子大小的谱带，以此分析不同菌种类群间的系统发育关系[5]。