核酸序列测定
DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析 （测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列
基因转染技术
将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。
一 CTAB 法微量提取植物总DNA
1. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的作用：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
2. β-巯基乙醇的作用：巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚轻易去除基因组DNA。巯基乙醇有消泡的作用。
3. EDAT（乙二胺四乙酸）的作用：是一种重要的络合剂，抑制某些金属蛋白酶的活性，防止DNA被DNase 酶解。
4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？
在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
分子生物学中的基本实验技术
分子生物学是生物学中的一个重要分支，它研究的是生物体中的分子结构和功能。分子生物学的研究对于生物科学的深入发展具有非常重要的意义，因此有许多实验技术被应用于分子生物学的研究中。今天我将为大家介绍分子生物学中的基本实验技术。
1. PCR技术
PCR技术是分子生物学中最常见的实验技术之一，全名为聚合酶链式反应。这个技术的主要作用是在一定时间内通过不断复制DNA分子，使其数量快速增加。PCR技术的原理是利用DNA聚合酶逆转录DNA为RNA，然后复制RNA为DNA，从而使得DNA的数量快速增加。这个技术对分子生物学的研究非常重要，因为可以快速扩增特定目标DNA序列，用于检测基因改变、氨基酸替换等。
2. 克隆技术
克隆技术是一种基于DNA分子复制的实验技术，它通过将特定的DNA序列定位在DNA分子的特定位置，使其可以被快速复制。这个技术对于分子生物学的研究也非常重要，因为可以通过克隆技术复制从许多不同物种中获得的DNA分子，从而使其进行深入研究。现在，克隆技术已经成为了分子生物学中最常用的实验技术之一。
3. 基因测序技术
基因测序技术是一种对DNA分子进行测序的技术，它对于分子生物学的研究也非常重要。通过基因测序技术，可以快速测定DNA分子的序列，从而更好地了解其功能和结构。基因测序技术也是现代医学研究中最常用的技术之一。
4. 基因编辑技术
基因编辑技术是一种用于改变生物体内基因结构的实验技术。现在，有一些高效的基因编辑技术被发明，其中最为热门的是CRISPR/Cas9技术。通过这个技术，可以快速实现基因替换、氨基酸替换等，这对于生物医学研究来说非常重要。
5. 免疫印迹技术
免疫印迹技术是一种检测特定蛋白质的实验技术，对于分子生物学的研究也非常重要。通过免疫印迹技术，可以检测特定蛋白质的存在和表达水平，从而更好地了解它们在生物体内的作用。
总之，分子生物学中的实验技术非常多，但是以上几种技术是最为基础和常见的实验技术。这些实验技术的出现和发展，推动着分子生物学的发展，也为人类的生命科学研究和医学治疗提供了众多的手段。
分子生物学常用实验技术
第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定
第二章 DNA酶切及凝胶电泳
第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第四章 RNA的提取和cDNA合成
第五章 重组质粒的连接、转化及筛选
第六章 基因组DNA的提取
第七章 RFLP和RAPD技术
第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第九章 分子杂交技术
第十章 测序技术
第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定
第一节 概 述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,
并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和
转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于
宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内
只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有
许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、
染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可
由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
