阳离子交换层析柱

离子交换层析介质的应用

离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。

子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

1.离子交换层析的基本原理：

离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。

离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。

由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。

2.离子交换层析介质：

离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。

一、 原理：

有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：

R-SO3H＋M+ ———— R-S3M＋H+

或R-NH3OH＋CL－ ————— R-NH3CL＋OH－

这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。

二、 目的与要求：

本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。

三、仪器与装置：

玻璃层析柱：长19cm，内径1.2cm，3# 砂芯。

HL-2型恒流泵。

HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。

BS-100A自动部份收集器。

250ml烧杯。

1ml吸管。

水浴锅。

72型（或721型）分光光度计。

四、 试剂与药品：

树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。

洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C6O7H8•H2O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于 水中稀释至10升。

样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。

显色剂：显色剂列出两种可任选一种。

显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。

10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%）

显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。

0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml

A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。

离子交换柱层析分离核苷酸

来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-08-06

一、实验目的

本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。

本实验的目的是：

1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法

2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法

3. 熟练掌握紫外吸收分析方法

二、实验原理

1. RNA的碱水解

实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物；用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解则分别可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。

RNA用碱水解，经过2’、3’一环核苷酸中间物，而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下图所示。

碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。

2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离

离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。

离子交换层析介质得应用

离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。

离子交换层析(Iｏｎ Excｈａnｇｅ Chromatｏgraphｙ 简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。

1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。

离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。

由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。

2、离子交换层析介质:

离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中得某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就就是离子交换层析得基本置换反应。通过在不同条件下得多次置换反应,就可以对溶液中不同得离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析得基本分离过程。