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经典液相色谱法

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经典液相色谱法

经典液相色谱法
（六）定性与定量分析
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂

经典液相色谱法平面色谱分析

经典液相色谱法平面色谱分析
0.1~0.2 >5000 3~6 3 ~ 20 0.1 ~ 0.5 5 ~ 10
18.6 纸色谱法
18.6.1 纸色谱法的分离原理 paper chromatography
～是以纸为载体的色谱法，分离原理
属于分配色谱的范畴。
固定相：纸纤维上吸附的水分。(或甲酰胺、 缓冲液等滤纸可以吸留的物质。) 流动相：不与水相混溶的有机溶剂。或可与 水混溶的溶剂。
l2、l1分别为原点至两斑点中 心的距离， d为两斑点中心间的距离 ，W1、W2为斑 点的宽度。
分离数 定义在相邻斑点分离度为1.177时，在
Rf 0和Rf 1两种组分斑点之间能容纳的 色谱斑点数。
SN l0 /b0 b1 1
其中，b0、b1为Rf 0和1时组分的半峰宽， 二者由外推法获得。
c.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的
点样线上，点样线一般距薄层底边 1.5~2cm， 点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0 cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一 般原点直径不超过2~4mm为宜。
展开和展开剂的流速
展开
先预饱和。展开前，将薄层板置于盛有展 开剂的色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与 展开剂直接接触，当色谱缸内展开剂蒸汽、薄 层与缸内大气达到动态平衡时，即饱和时，再 将薄层板浸入展开剂中，称预饱和。
常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、 酚等，即含水的有机溶剂。
为了防止弱酸、弱碱的离解，加入少量 的酸或碱。如甲酸、醋酸、吡啶等。
纸色谱的操作步骤有点样、展开、显色、 定性定量分析几个步骤。
复习题
1、在硅胶薄层板A上，以苯－甲苯（1:3）为 展开剂，某物质的Rf值为0.50，在硅胶板B 上，用相同的展开剂，此物质的Rf值为0.40， 问哪块板的活度大？

经典液相色谱法

经典液相色谱法

例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿
距离为16.0 cm 时，两斑点质量重心至原点的距离分别为 6.9 cm 和5.6 cm，斑点直径分别为0.83 cm 和0.57 cm。 求两组分的分离度及Rf 值。 解：
2d 2 (6.9 5.6) R 1.9 W1 W2 0.83 0.57
一般低温展开效果较好 温度 物质极性
•
展开剂极性 展开剂极性↑ Rf 极性物质Rf ↑ 亲脂性组分Rf ↓ 展开剂蒸气
极性大，Rf小 极性小，Rf大
•
对Rf 影响较大，应先让溶剂蒸气将层析缸饱和
例:用纸色谱分离，正丁醇为流动相，比较下面三个化合物的 Rf
CHO HC HO CH HC HC OH OH OH
1 Rf 1 k
k (1 Rf ) / Rf
Vm: 薄层板的死体积; K: 该条件的分配系数
VS: 板固定相体积;
在色谱条件确定的情况下，K大Rf 小，K小Rf 大。
分离物质性质 薄层板性质 Rf 影响因素 展开剂极性 温度 展开剂蒸气饱和程度
(2) 相对比移值 (retardation factor, Rr ) 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。 可用相对比移值定性。
5.6 0.35 16.0
Rf,A
6.9 0.43 16.0
Rf,B
四. 薄层色谱法
点样
展开
过程：铺板→活化→点样→饱和→展开→显色→定性定量
1. 原理:
将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密
闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断 地被吸附, 解吸附… 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分 的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。

经典色谱法液相

经典色谱法液相
39
展开系统旳优化
苯—醋酸乙酯—甲醇—异丙醇—浓氨水 （6：3：1.5：1.5：0.5）
40
3、展开过程旳控制
（1）展开方式：屡次、分步展开
A B
一次展开
A B
屡次展开
41
展开过程旳控制
（2）溶剂蒸气旳饱和程度 ①产生边沿效应
原因：低极性低沸点物质在薄层板边沿易挥发
克服方法： a “预饱和” b 层析缸内壁贴浸湿旳滤纸条 c 点样时不要太靠边沿
理论互换容量：每克干树脂具有可互换基团旳数目 实际互换容量：每克干树脂真正参加互换旳基团数目 用酸碱滴定法测定，单位以mmol/g表达。树脂旳互换容量 一般为1～10mmol/g。
15
2、性能
③再生
互换
RSO3-H+ + Na+ + Cl- 再生 RSO3-Na+ + H+ Ʊ+OH- + Na+ +Cl- 再生
薄板：玻璃、塑料薄膜、铝箔 吸附剂：硅胶、氧化铝
26
二、硅胶薄层色谱法
（一）分类： 硅胶H、硅胶G、硅胶HF254、硅胶GF254 G：指含煅石膏(Gypsum)黏合剂
H：不含黏合剂
F254：含一种在254nm下能发出黄绿 色荧光旳无机荧光剂
F365：含荧光剂，365nm紫外光照发光
含荧光剂旳硅胶合用于本身不发光又无合适显色剂显色 旳物质
粒度：10~40μm(250~300目） 27
（二）分离机理
1、样品分子与展开剂分子对硅胶表 面硅醇基旳竞争吸附 2、展开剂对样品分子旳溶解
28
硅胶薄层色谱法
（三）操作措施： 制板 点样 展开 检视

经典液相色谱法

经典液相色谱法
展开剂 苯 苯+甲醇 Rf（A） 0.45 0.38 Rf（B） 0.42 0.52 分离效果 分不开 分开
问：A、B哪个组分的极性大
答：B的极性大。展开剂极性增大，极性大的Rf 值增大。
分析化学课件
液 -固...
离子交 ...
薄层色 ...
纸色谱 ...
小
结
习
题
3.5 点样与展开
3.5.1 点样 点样量一般1-几十μg， φ 2-3mm
空间排列, 影响极性。
常见化合物极性： 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂类 < 酮类
< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类
分析化学课件
液 -固...
离子交 ...
薄层色 ...
纸色谱 ...
小
结
习
题
空间排列, 影响极性。
OH C O O H O
题
3.4 展开剂选择
分离强极性物质，选择强极性展开剂，同时也 应考虑固定相的活性
物质极性
大 小
吸附力
强 弱
流动相极性
大 小
防止
Rf太小 Rf太大
分离混合样品时，先用单一中等极性展开剂尝 试，再摸索二元展开剂。
分析化学课件
液 -固...
离子交 ...
薄层色 ...
纸色谱 ...
小
结
习
题
例：A，B两组分的试样
分析化学课件
液 -固...
离子交 ...
薄层色 ...
纸色谱 ...
小
结

经典液相色谱法

经典液相色谱法
4.洗脱顺序
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→
柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。 平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。
❖ 附：常见化合物极性
❖ ①见登山图1
❖
②双键↑，吸附力↑
羧酸 酚
❖
③分子内氢键，吸附力↓
醇 酰胺
胺类
酮 酯 二甲胺
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
✓ 分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
局限： ✓ 不能分离大小相近的化合物 ✓ 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。
应用
✓ Kp∝尺寸∝相对分子质量——
可应用于高分子分子量的测定
➢ 结论：
分 类：
平面色谱
薄层色谱 (TLC) 纸色谱 （PC）
吸附薄层色谱 分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL0离
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类

经典液相色谱法2


吸附剂粒径对展开速度、Rf 值和分离效果的影响： • 颗粒大，则总表面积小，吸附量低，展开速度快，展 开后斑点较宽，分离效果差。 • 颗粒太小，则展开速度太慢，而且不易用干法铺板。 因此，应该选用颗粒大小适宜的吸附剂，而且其 粒度分布要窄。 吸附剂颗粒大小表示方法： • 颗粒直径(以µm表示)， • 筛子单位面积的孔数(以目表示) 干法铺板所用吸附剂颗粒直径一般在75～100µm 或150～200目较为合适，而湿法铺板则用更细的颗粒， 为10～40µm或250～300目。聚酰胺则一般在100～180 目范围内。高效薄层板的颗粒直径为5～10µm。
在薄层色谱使用的一般条件下，固定相、流动 相都不很明确，它们都与蒸汽相一起维持着一种变化 的状态，在分离过程中这三相都可能不断在变化。 • 在使用混合溶剂时，在展开过程中极性较弱、沸点 较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的 展开剂中极性溶剂的比例增大，使Rf值相对变大。同 一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的 Rf值小，这种现象称为边缘效应。
2. 软板的制备：直接铺制吸附剂。 3. 粘合薄层板(硬板)的铺制 (1)粘合剂：粘合剂的种类与用量会影响分离的效果，常用 的有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMC−Na) 和某些聚合物 如聚丙烯酸等。参看《分析化学实验》。 (2)倾注法制板：1. 在玻板上倾倒吸附剂糊，2. 用洁净玻棒 涂铺均匀，3. 稍加振动。 (3)平铺法制板：在水平台面上先放置玻璃平板，上面放置 载板，二边加上玻璃条做成的框边(框边高于载板0.25～ lmm)，将吸附剂糊倒在载板上，刮平并振动均匀。 上述两法所铺薄层板只适宜于一般定性分离，不宜 于定量分离。
2．相对比移值 (Rr) 由于影响 Rf 值的因素很多，要在不同实验室、不 同实验者间严格控制色谱条件的一致性，达到 Rf 的可 比性很困难。因此建议采用相对比移值(relative Rf ；Rr) 作为定性参数： Rr = Rf (a)／Rf (s) =la／ls (19·2)

经典液相色谱法

依据规律：
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质

经典液相色谱法

O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H n
10
酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
26
体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a

Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
13
1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。

经典液相色谱分析技术—薄层色谱分离分析技术


定量毛细管
全自动点样仪
全自动点样仪
平口微量注射器
仪器分析技术
四、展开容器
展开缸应适合薄层板的大小，并配有严密的盖子，展开缸底部应 平整光滑，侧面应便于观察，常用的有以下两种。
平底色谱专用展开缸
双槽薄层色谱专用展开缸
仪器分析技术
五、显色剂
✓ 通用型：与多数有机化合物反应，显示相同颜色斑点 ✓ 专属型：对特定官能团化合物起反应，显示特定颜色斑点。
• 由于参考物与组分在完全相同的条件下展开，能消除系统 误差，重复性和可靠性都比比移值好。
• Rr可以大于1，也可以小于1。
仪器分析技术
谢谢观看！
仪器分析技术
薄层色谱分离分析技术
——薄层色谱参数介绍
仪器分析技术
主要内容
1
相平衡参数
2
分离度
仪器分析技术
一、相平横参数 分配系数K= Cs/Cm
K、k与Rf值的关系：
（ 0.2%～0.5% ） 。具体操作如下
2、市售薄板 ➢ 普通薄层板：玻璃、聚酰胺薄膜、铝基薄层板 ➢ 高效薄层板：固定相粒径为5-7μm
仪器分析技术
自制薄板的操作方法
将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一 方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布 器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm～0.3 mm) ，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30分钟， 立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。
硅胶类薄层板
仪器分析技术
二、点样
普通板 点样基线：距底边2.0cm 圆点状：直径≤3mm 条带状：点样宽度5～10mm 点或条带间距：＜8mm 点样量：＜10μl
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第一节 吸附色谱法
硅醇基有两种形式，一种是游离羟基(Ⅰ)，另一
种是键合羟基(Ⅱ)，当硅胶加热到200℃以上时，失
去水分，使表面羟基变为硅醚结构(Ⅲ)，后者为非
极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去

色谱活性。
H
HH
O
OO
S i (Ⅰ) S i S i (Ⅱ)
O Si Si
(Ⅲ)
由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类
第一节 吸附色谱法
(二)薄层色谱 按薄板的分离效能，可分为经典薄层色谱法(TLC)
及高效薄层色谱法(HPTLC)两类。 薄层色谱有下列一些特点：
(1)展开时间短，一般只需十几分钟到几十分钟； (2)分离能力较强，一块板可分离多达约20个组分； (3)灵敏度高，通常使用的样品量为几至几十微克； (4)显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂； (5)所用仪器简单，操作方便； (6)
通常在低浓度时，每种等温线均呈线型，而高
第一节 吸附色谱法
1．线型吸附等温线 是理想的等温线 当吸附平衡常数K一定时，其吸附等温线为
线型，即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中浓度Cm成正比，直线的斜率 为K。
第一节 吸附色谱法
2 在几乎所有的实际情况下，吸附等温线都有
些弯曲而呈非线型。一般液-固吸附色谱系统大 多呈现凸形吸附等温线。
透射法测定时，SX值越大，吸光度越大；反射法测 定时，SX值越大，反射度越小。
SX值取决于薄层吸附剂的性能、粒度和分布情况。 SX值要预先测定，通过仪器的线性补偿器，用电路系统 将弯曲的曲线校正为直线后用于定量。
线形校正 1-校正前的标准曲线 2-校正后的标准曲线
第一节 吸附色谱法
②扫描方式 扫描方式分线性(直线)扫描和锯齿(曲折)扫描法。
第一节 吸附色谱法
A. 线型 B. 凸型 C.凹型 a. 吸附等温线 b. 相应的洗脱峰型
第一节 吸附色谱法
二、吸附剂 吸附色谱法对吸附剂有下面几点基本要求： ① 有较大的表面积，有足够的吸附能力，但对 不同物质其吸附能力又不一样； ②与洗脱剂、溶剂及样品不起化学反应，并在 所用溶剂和洗脱剂中不溶解； ③ 粒度均匀，粒度要细。
第一节 吸附色谱法
五、定性与定量分析 (一) 1.比移值Rf
在薄层色谱法中，常用 比移值Rf来表示各组分在 色谱中的位置。
原点至斑点中心的距离
Rf 原点至溶剂前沿的距离
Rf与分配系数K及容量因子k之间的关系为：
Rf
1 1 1 K Vs 1 k
Rf值为常数，V其m 值在0～1之间。
Rf =0，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移 动，仍在原点位置；
(一)吸附与吸附平衡 吸附是吸附剂、溶质、溶剂分子三者之间的复
杂相互作用。 吸附平衡常数K
K 溶 溶质 质在 在流 固动 定相 相中 中的 的浓 浓CC度 度 ms
不同的溶质有不同的K值，一个组分的色谱特性 完全由吸附平衡常数K决定。
第一节 吸附色谱法
K值大说明该物质被吸附得牢，在固定相中 停留时间长，在柱中移动速度慢；
预制板是由工厂生产出来的商品板，使用方便，涂 布均匀，薄层光滑，牢固结实，分离效果及重现性好。 品种繁多，规格齐全，能满足不同的分析要求。
第一节 吸附色谱法
2 点样体积：经典薄层一般为1～10μL，高效薄层为
100～500nL； 点样形状：一般为圆形点，点样基线距底边1.0～
1.5cm，样点直径为2～3mm，高效薄层原点直径 约为1mm，要尽可能避免多次点样； 点间距离：可视斑点扩散情况而定。一般经典薄层为 1～2cm，高效薄层为0.5cm； 常用的点样器具：定量毛细管（0.5、1、2、3、4、5和 10μL）和铂铱合金毛细管（100nL和200nL），另 一类是注射器式的可变体积 微量点样器和毫微点样 器，用手工点样时常用定量毛细管。
锯齿形扫描方式能消除展开后斑点形状不规则而引 起的误差，可获得满意的定量结果。 ③双波长法扫描
光源的光分两路，通过两个分光器出来两束不同波 长的光。一路用于测量样品，称样品波长λS；另一路 做为对照，称参比波长λR。 双波长法可以消除斑点处薄层本身的干扰，消除薄 层厚度不均匀引起的基线波动，能可靠地检测痕量组分.
第一节 吸附色谱法
（2 ①喷雾显色 将显色剂用电动薄层喷雾器直接喷洒于硬
板上，根据显色剂的不同，可直接显色或加热显色。 ②浸渍显色 也可用浸渍法处理薄层，使生成颜色稳
定、轮廓清楚、灵敏度高的色斑。利用某些物质的蒸 气与样品作用生成不同颜色或产生荧光，也可用于斑 点的检出。 ③蒸气检出法 多数有机化合物能吸附碘蒸气而显示黄 色斑点。有些化合物遇碘蒸气后发生紫外吸收的变化
第一节 吸附色谱法
(一)常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。其中以硅
胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。 1.硅胶 2. 氧化铝
第一节 吸附色谱法
1.硅胶 其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，这
种表面吸附水称为“结合水”，加热至105℃～ 110℃左右能除去，除去的水分越多，吸附能力 越强。
硅胶的活性与含水量有关，“结合水”高达 17%以上时，吸附能力降低。
Rf =1，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶 剂同步移动。
一般要求Rf值在0.2～0.8之间。
第一节 吸附色谱法
影响Rf值最重要的因素是吸附剂的性质与展开 剂的极性和溶解能力。
当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被
测物质的Rf 1．薄层厚度 2．展开距离 3．展开容器中展开剂蒸气的饱和度 4．点样量 5．薄层含水量
愈高，其吸附活性愈低，活性级数愈大，吸附力就 愈弱。反之亦然，含水量愈低，其活性愈高，活性 级数愈小，吸附力就愈强。
吸附剂使用前必须先经过活化处理。在一定 温度下，加热除去水分以增强活性的过程称之为活 化。反之，加入一定量水分便可使其活性降低，亦
分离极性小的物质，一般选用吸附活性大的吸 附剂，反之，分离极性大的物质则应选用活性小的 吸附剂。
第一节 吸附色谱法
F
d3
薄层点样示意图
××××××
s1 2s 12
d2
d1
S-对照品溶液； 1.2-样品溶液；×－原点； d1-点间距离；
d2-原点与板底边距离；d3-展距；F-溶剂前沿
第一节 吸附色谱法
3 点样后的薄层，置密闭的玻璃槽中，用合适的
展开剂展开。展开剂浸入薄层下端高度不应超过 0.5cm。点样处不可接触展开剂，展距一般为8～ 15cm。
第一节 吸附色谱法
（2）定量方法 ①外标法 分为外标一点法和外标二点法。 A 外标一点法
工作曲线通过原点（截距为零） 时可用外标一点法定量，需点一种 浓度的对照品溶液。
C＝F1·A
C为样品的浓度或重量，A为样品的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数
B 外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定
第二十章 经典液相色谱法
经典液相色谱法
经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动
相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 现代色谱法灵敏度高，分离效率高。但经典色谱法 也有许多优点，设备简单，操作方便，分析速度快。
第一节 吸附色谱法
量，至少要点在同一薄层板上二种不同浓度的对照 品溶液(或一种浓度两种点样量) 。
CF 1AF2
F1 和F2都是通过测量随行的对照品溶液的浓度（C1和C2）和 峰面积（A1和A2）求出，所以这种方法又叫随行标准法。
第一节 吸附色谱法
②内标法 本法与外标法的主要区别，在于用内标法时面
积累计值为被测样品和内际物的面积之比。由于内 标物与被测物的测定是在同—通道上，因此要求内 标物的吸收波长接近被测物质的吸收波长，并与被 测物质的斑点要完全分开。因而，内标物的选择比 较困难。
第一节 吸附色谱法
制备含粘合剂的硬板，要先制备固定相的匀浆，调 制固定相的匀浆时可将一定量的固定相按上表比例加入 适量水或粘合剂，在研钵中或在匀浆器中调匀，倒入手 动或自动涂布器中涂布。室温下阴干后，活化后备用。
定性定量分析时薄层厚度为0.3～0.5mm，制备薄 层厚度为0.5～2mm。 （2）预制板
第一节 吸附色谱法
选择色谱分离条件时， 必须从吸附剂、被分离 物质、流动相（展开剂） 三方面综合考虑。
组分
吸附剂 流动相
极性
活性小
极性
非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性
第一节 吸附色谱法
(一) 1. 色谱柱的制备 (1)玻璃柱 干装法
湿装法 (2) 尼龙柱 用于色谱分离的尼龙柱，应具备下列条件： ①应有一定的强度，且易于切割； ②对有机溶剂呈惰性，且能用手工热封；
Rst值可以大于1
第一节 吸附色谱法
1．间接定量法 (洗脱测定法) 薄层展开后，将被测物
斑点或区带捕集，用溶剂洗 脱，然后再用适当的分析方 法(比色法、分光光度法、 气相色谱、荧光分析法等)
2．薄层扫描法 该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多
组分物质和微量组分的定量。 （1）薄层扫描仪
薄层扫描仪光学 系统结构示意图
第一节 吸附色谱法
1 （1）手工制板
手工制板所用的玻璃板，除另有规定外，一般 为10cm×10cm,10cm×15cm,20cm×10cm或 20cm×20cm的2mm厚规格，要求板面平整，洗净 后放置在薄层板放置架上备用。然后用手动或自动 涂布器将已调好的固定相均匀地涂铺在玻璃板上。 最好用自动涂布器。
要使混合物中各个组分实现相互分离，则它 们的K值相差必须足够大，且K值相差越大，各 组分越容易彼此分离。
第一节 吸附色谱法
(二)吸附等温线 吸咐等温线是指在一定温度下，某一组分在固定
相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓 度Cs为纵坐标，以组分在流动相中的浓度Cm为横坐 标得到的曲线。