根际及内生菌控制小桐子XXX病害的初步研究实验方案

根际及内生菌控制小桐子XXX病害的初步研究
1 材料
1.1供试作物及病原菌
材料：小桐子
小桐子病原菌：(由……..提供)
1.2 培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂18 g、水1000 mL、调节PH 7.2—7.4。

（斜面及平板培养）
在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。

待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。

等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.4,转入锥形瓶用高压蒸汽灭菌30分钟。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然，马铃薯去皮切成块煮沸20min，然后用纱布过滤，再加入葡萄糖和琼脂，补蒸馏水至1000ml。

121℃、0.11MP灭菌30min（加入5g蛋白胨/1000ml用于真菌培养及拮抗测定）。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，加5M NaOH 调pH至7.0
1.3 常用药品：10%NaoH、10%Hcl、70%酒精、2 ％次氯酸钠、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、马铃薯、葡萄糖、无菌水、磷酸盐（PBS，pH 6.8）
1.4 主要仪器及用具
电子天平、酒精灯、锥形瓶、9cm培养皿、接种环、灭菌锅、烧杯、滴管、量筒、容量瓶、酸度计、研钵、显微镜、载玻片盖玻片
1.5 常用试剂：
结晶紫染液：溶液Ⅰ：结晶紫2g，酒精（95％）20ml 溶液Ⅱ：草酸铵0.8g，蒸馏水80ml 溶液Ⅰ和溶液Ⅱ分别配好后混合。

碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml
蕃红：蕃红2.0g，蒸馏水100ml。

孔雀绿：孔雀绿5g，蒸馏水100ml。

二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。

格里斯试剂：溶液Ⅰ：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10％左右）150ml。

溶液Ⅱ：α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，稀醋酸（10%左右）150ml
方法
2.1 分离培养基的选择
取小桐子组织，表面消毒后无菌剪刀剪碎，置于灭菌的研钵中，加入一定量无菌水，研磨，各取1mL的液体，10倍递减稀释分别涂布LB、NA平板，于28℃下培养24 h，计数，计算出在不同培养基上的菌落形成单位（CFU/ g），同时，比较不同培养基平板上长出的菌落类型。

根据不同培养基上的菌落数和菌落类型，选择最佳的分离培养基。

2.2 小桐子内生细菌的分离纯化
内生菌分离：用组织破碎分离法，取小桐子组织经自来水反复冲洗后，用无菌水冲洗4～5次，用70 ％酒精浸洗5 min，分别用2 ％次氯酸钠消毒8、10、12、14、16、18 min，无菌水冲洗4～5次，取最后一次无菌水冲洗液涂抹NA平板，进行无菌检验，筛选次氯酸钠的最佳消毒时间。

取灭菌彻底的各种组织置于无菌研钵中加入10mL 磷酸盐（PBS，pH 6.8）后研磨，静置5分钟。

取上清液进行十倍递减稀释，取10-1、10-2、10-3三个浓度涂抹NA 平板，0.1 mL／平板，重复三次。

接种后的平板置于26～28 ℃培养2～3 d，计数。

纯化：划线培养，根据菌落的形态，颜色，大小等形态特征挑取培养特征相异的单个菌落，反复划线纯化培养后，挑单菌落移入试管斜面保存。

即用灭菌的接种环沾取材料在平板的一边做第一次“Z”划线，转动70。

角，将接种环在酒精灯上烧过并冷却后，通过第一次划线部分做第二次划线，同法，划第三次。

接种好后26~28度倒置培养，划线培养，直至得到纯培养体。

低温保存备用。

2.3 对病原真菌有拮抗作用的内生细菌的筛选测定
在100 mL熔解后冷却至45℃左右的NA培养基中加入1 mL病原细菌菌液,混匀后制成含菌平板,然后在每个平板上均匀的接种内生菌株,培养24 h后测定抑菌透明圈的大小。

对真菌的拮抗测定:在PDA平板中央接入直径为5 mm的病菌菌块,用对峙法每平板接种3个培养24～48 h的活性菌株进行拮抗菌真的筛选,26℃下培养48～96 h,观察抑菌带的有无。

以无菌水代替内生细菌菌液接种处理为对照，26～28 ℃培养3 d后，观察是否有抑菌圈产生，当对照病原菌长至培养皿边缘时测病原菌菌落直径，计算相对抑菌率，每菌株重复三次。

将筛选出的具有拮抗作用的内生菌与供试病原菌对峙培养，2菌相距3cm，根据病菌菌丝生长的速率及菌落大小测定抑菌率的强弱，重复3 次。

以无菌水代替内生细菌菌液接种处理
为对照。

相对抑制百分率=（对照菌落直径–处理菌落直径）／（对照组菌落直径–菌饼直径）×100 ％
2.4 活性物初步测定
筛选到拮抗性细菌后，尽快比较各菌株的拮抗能力，并选择高拮抗菌株进行发酵（发酵培养基黄豆粉10g，甘露醇10g，水1L，pH7.0～7.5）、过滤，用滤液浸泡灭菌纸片，然后放在接有病原菌的培养皿中；同时破碎菌体（反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

），并灭菌——这一步检查具有拮抗病原菌的活性物质是胞外分泌成分还是胞内成分，并比较两者的活性。

2.5 芽孢测定
加1~2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2~3环的菌体于试管中并充分混匀，制成浓稠的菌液。

加5%孔雀绿水溶液2~3滴于小试管中，用接种环搅拌使菌液与材料充分混合。

水浴加热15~20分钟。

用接种环挑取菌液于洁净的载玻片上，做成涂面。

将涂面经过酒精灯火焰三次固定。

用水洗，直至流出的水中无孔雀绿为止。

加翻红水溶液染色五分钟后，倾去染色液，直接用吸水纸吸干。

镜检观察是否有芽孢（芽孢呈绿色，菌体为红色）。

2.6 拮抗细菌的生理生化性质
生理生化特征主要是测定拮抗菌的NaCl 耐受度、接触酶、生长温度、淀粉水解、V- P 试验、硝酸盐还原、糖发酵试验醇发酵试验生理生化。

Nacl耐受度：在NaCl浓度分别为2%、5%、7%、10%的LB液体培养基中加入1％的培养16 h的细菌发酵液，28℃培养3-7天，与未接种的对照管对比，观察其生长情况。

接触酶：将待测定的细菌在NA平板上培养24h，用接种针挑取一些细菌涂布在干净的载玻片上，加一滴3％的H2O2，观察结果。

有气泡产生者为阳性反应，无气泡产生则为阴性反应。

硝酸盐还原试验：培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，KNO3 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0；将细菌接种在硝酸盐培养液中，做不接种的对照管，适温培养1、3、5d后，取少许的培养液放入到干燥的试管中，按顺序滴入格里斯氏试剂，在对照管中同样加试剂，如果溶液变粉红、玫瑰红或者橙色，则表示有亚硝酸盐的存在，为硝酸盐还原阳性，反之为阴性。

如无红色出现，则可加1-2滴二苯胺试剂，此时培养液如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐。

生长温度的测定：在LB液体培养基中加入1％的培养16h的细菌发酵液，分别置于40℃、50℃、55℃水浴中培养3-7天，与未接种的对照管相比，要3次移种生长者才能确认，观察其生长情况。

淀粉水解试验：培养基：NA培养基加0.2％可溶性淀粉；将培养基熔化后,冷却至50℃左右,倒成平板,凝固后,将待测菌接种在培养基上，适温下培养2-4d，形成菌落后,在平板上加一层卢哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已水解，透明圈的大小说明水解淀粉的能力大小。

糖或醇类发酵试验：基础培养基：0.1克磷酸氢铵，0.2克氯化钾，七水硫酸镁0.2克，酵母浸膏0.2g，蒸馏水1000mL，0.4％溴百里酚兰2mL，pH7.2，每100mL培养液中分别加入1g L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-葡萄糖、D-木糖；每试管装入5ml，1Kg压力灭菌20 min,每试管加入0.1mL菌液，置于28℃恒温箱培养48 h，观测结果。

指示剂由紫色变黄，表示糖类发酵产酸。