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拟南芥蛋白质组学研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛使用的模式植物，其蛋白质组学研究已成为生物学领域的热点之一。
拟南芥蛋白质组学研究是通过质谱技术对拟南芥体内蛋白质进行深度分析，探究蛋白质的结构、功能及相互作用等方面的研究。
本文就拟南芥蛋白质组学研究的相关内容进行探讨。
一、拟南芥蛋白质组学研究的背景近年来，随着生命科学研究的不断深入，研究者们越来越深入地研究蛋白质的结构、功能、相互作用及调控等方面。
而蛋白质组学的研究则可以在更广泛的层面上了解蛋白质的生命活动过程，拟南芥作为重要的模式植物，因为其基因组与其他植物相似，并且生命周期短、繁殖力强，使其成为理想的研究对象。
拟南芥蛋白质组学研究的发展，将有助于进一步认识细胞的生命活动，特别是了解植物特有的蛋白质谱系。
二、拟南芥蛋白质组学研究的方法1.样品制备拟南芥蛋白质组学研究需要完整、纯净的蛋白质样品。
样品制备的方法根据研究目的而异，一般可采用细胞分离或蛋白质酶解法等常规的制备方法。
分离细胞、组织是获得拟南芥蛋白样品的一种常见做法。
同时，还有一些针对特定蛋白的制备方法，例如用亲和层析纯化、蛋白悬浮物与融合蛋白结合等方法。
2.蛋白质分离分离可以通过电泳法（二维电泳、毒性电泳等）、毛细管电泳等方法进行。
其中，二维电泳是将蛋白质在两个方向上（等电聚焦、SDS-PAGE）分离后形成的图谱可以反映出蛋白质样品中的所有蛋白质，二维电泳曲线图中每一个斑点就代表了一个蛋白质。
3.质谱分析质谱技术是目前研究蛋白质组学的核心。
液质联用（LC-MS）技术、MALDI-TOF/TOF质谱技术等是目前应用最广泛的蛋白质组测定技术。
液质联用法是目前应用最广泛的质谱分析技术，主要是利用液相色谱与质谱联用的方法，其特点是分离快、通量大和灵敏度高等。
三、拟南芥蛋白质组学研究的应用与展望1.蛋白质结构及功能研究拟南芥蛋白质组学研究为功能生物学的研究提供了新的思路和方法。
《拟南芥锌转运蛋白ZNE1的亚细胞定位及其功能研究》篇一一、引言在植物生物学中，微量元素如锌（Zn）的转运和分配对于植物的生长和发育至关重要。
拟南芥作为一种重要的模式植物，其锌转运蛋白的研究对于理解植物对锌的吸收、转运和调控机制具有重要意义。
本文将重点探讨拟南芥锌转运蛋白ZNE1的亚细胞定位及其功能研究。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料为拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型植株及转基因植株。
实验中使用的分子生物学试剂、培养基等均为市售优质产品。
2.2 方法（1）亚细胞定位研究：采用基因克隆技术，将ZNE1基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合，构建融合蛋白表达载体。
通过农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达系统，观察ZNE1蛋白在细胞中的定位。
（2）功能研究：通过生物化学、分子生物学及遗传学手段，分析ZNE1在拟南芥中的功能，包括对锌的转运、吸收及对植物生长的影响等。
三、结果与分析3.1 ZNE1的亚细胞定位通过与GFP融合的ZNE1基因在烟草叶片中的瞬时表达，我们发现ZNE1蛋白主要定位于细胞膜上，表明ZNE1可能参与锌的跨膜转运过程。
此外，我们还观察到ZNE1在细胞质中也有一定程度的分布，这可能与其在细胞内的锌平衡调节中发挥作用有关。
3.2 ZNE1的功能研究（1）锌转运：通过比较野生型拟南芥与ZNE1敲除植株在不同锌浓度下的生长状况，我们发现ZNE1在维持植物体内锌平衡方面发挥重要作用。
在低锌条件下，ZNE1能够协助植物吸收和转运更多的锌，以满足生长需求；而在高锌条件下，ZNE1则能够调控锌的转运，避免过量锌对植物造成毒害。
（2）植物生长：ZNE1的表达水平与拟南芥的生长状况密切相关。
在缺锌或过量的锌环境中，ZNE1的表达水平会发生变化，从而影响植物的生长和发育。
通过对转基因植株的研究，我们发现ZNE1过表达可以显著提高拟南芥在低锌环境下的生长速度和生物量。
这表明ZNE1在植物应对锌缺乏压力时具有重要作用。
拟南芥AtJ70的组织特异性表达及亚细胞定位贾宁;丁正洁;李冰【期刊名称】《河北师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2011(35)3【摘要】以野生型和PAtJ70:GUS转基因拟南芥为材料,以定量PCR和GUS染色方法研究了拟南芥J-蛋白AtJ70的组织特异性表达.结果显示AtJ70基因在根、茎、叶、花和果实中都有表达,花和叶中表达最高,长角果和根中次之,茎中最低.此外,以AtJ70-mGFP4转基因拟南芥为材料,使用激光共聚焦显微镜研究了AtJ70的亚细胞定位.结果显示,AtJ70主要定位于细胞核中.【总页数】6页(P299-304)【关键词】拟南芥;AtJ70;组织特异性表达;亚细胞定位【作者】贾宁;丁正洁;李冰【作者单位】河北师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q94【相关文献】1.拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析 [J], 周苹;崔溢;邓克勤;郭新红;喻达时;张继红;刘选明2.拟南芥LRR-RLKs亚家族蛋白RLK6的亚细胞定位及RLK6的组织表达 [J], 阿依江·哈拜克;杨敏;韩玉珍3.拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达 [J], 邓克勤;郭新红;汪启明;刘选明4.细胞色素P450 CYP81A6基因在水稻中的表达：组织特异性、蛋白质亚细胞定位以及对除草剂的响应 [J], Hai-ping LU; Martin EDWARDS; Qi-zhao WANG; Hai-jun ZHAO; Hao-wei FU; Jian-zhong HUANG; Angharad GATEHOUSE; Qing-yao SHU5.海马齿Spmet基因表达产物的亚细胞定位及其组织表达特异性分析 [J], 申龙斌;李瑞梅;段瑞军;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物细胞中氨基酸转运蛋白的一些已知或未知的功能膜蛋白对于氨基酸在细胞和细胞器之间的进出是非常必要的。
虽然很多推定的氨基酸转运蛋白已经被识别，但仅仅只有一些蛋白对植物细胞氮元素的转运功能起作用。
那些研究证实内流系统在细胞和整个植物水平的氨基酸分离中有着基础性的作用。
生理学的数据进一步表明氨基酸转运蛋白是植物新陈代谢的主要调节者，它们的活性会影响到植物的生长和发展。
相反地，氨基酸外排系统和细胞之间的转运载体的分子机制的研究还很少。
同样地，氨基酸转运蛋白的功能和参与氨基酸信号的转运蛋白的调控也是知之甚少。
未来的研究需要确认缺失的部分，阐明对整个植物生理和生产能力具有重要作用的氨基酸转运蛋白。
引言植物中的氨基酸有着高度不同，扮演着必要的角色。
通过构建酶和蛋白的模块，它们为植物的新陈代谢和结构提供了重要的成分。
此外，它们还是对植物起重要作用复合物的前体或者氮元素的提供者，这些复合物包括核苷酸、叶绿素、激素和次级代谢物。
植物可以从土壤中直接吸收氨基酸或者将无机氮（硝酸盐和铵）合成氨基酸。
20种氨基酸中很多是在根部和叶子中的质体中合成，但它们也会在细胞内其他细胞器中合成，包括线粒体、细胞质和过氧化物体。
依据合成，氨基酸会被用于新陈代谢，瞬时贮存，或者转运到韧皮部进行营养生长和生殖生长。
氨基酸在细胞或者细胞器，以及从源到汇器官的运输在细胞或亚细胞膜中都需要有外排或内流转运功能的蛋白。
不同转运蛋白家族对于氨基酸在植物细胞中的内流作用已经被识别至少在18年前，第一个植物氨基酸转运蛋白AAP1/NAT2（氨基酸透性酶1）在拟南芥中被识别。
AAP1属于这个家族的8大成员之一（AAP1-8），它们分别转运酸性、中性和碱性的氨基酸。
截止到现在，建立在不同的互补实验和序列同源性的基础上，有超过60种的可推测的氨基酸转运体已经在拟南芥中被识别出来了。
转运体在不同系统中通过功能分析表达和局部研究，进一步表征，大部分参与了植物细胞吸收氨基酸的过程，它们属于AAP（氨基酸透性酶）、LHT（类似赖氨酸和组氨酸转运蛋白）、ProT（脯氨酸转运蛋白）、ANT1-like（类似ANT1的芳香族和中性氨基酸转运蛋白）、GAT（γ-氨基丁酸转运蛋白）和CAT（阳离子氨基酸转运蛋白）。
拟南芥中WRKY家族基因功能的研究进展作者：钱金鑫齐学军解莉楠等来源：《安徽农业科学》2014年第05期摘要在植物体中转录因子通过与顺式作用元件相结合对功能基因进行转录调控，完成复杂的生命活动。
文中综述了WRKY转录因子的特点及分类，以及拟南芥对环境胁迫进行应答过程中WRKY转录因子发挥功能的机制，为WRKY家族基因功能的进一步开发利用提供依据。
关键词拟南芥；WRKY；转录因子；胁迫；应答中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01295-03Abstract Transcription factors regulate transcriptional level of functional genes by binding to cisacting element.This process makes plant complete life activities.The types and characters of WRKY transcription factors and functional mechanism of process in which WRKY participate in responding to environmental stress were reviewed，so as to provide a basis for further development and utilization of WRKY family gene function.Key words Arabidopsis thaliana； WRKY； Transcription factors； Stress； Response在自然界中，由于植物不能移动，所以会频繁的遭受各种生物及非生物环境因素的影响，如：病原菌、水分缺失、盐分过多和极限温度等。
植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期： ２００５－１２－２０； 接受日期： ２００６－０３－０７基金项目： 科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研） （２００３ＣＣＡ０１１００）＊ 通讯作者 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）摘要 生物信息学分析表明， 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４ ０００多种蛋白质， 目前只分离得到１ ０００多种， 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。
本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。
我们克隆了该基因５＇端长１７８ ｂｐ的ＤＮＡ片段， 与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。
转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察， ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。
实验结果表明， ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。
本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。
关键词 融合蛋白， 亚细胞定位， 转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ Ｗａｎｇ１， Ｃｈｅｎ Ｗａｎｇ１， Ｈｕａｌｉｎｇ Ｍｉ２， Ｇｅｎｙｕ Ｚｈｏｕ１， Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０００３２）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｈａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａｂｏｕｔ ４ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｏｎｌｙａｂｏｕｔ １ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｖａｌｉｄａｔｅｄ． Ｔｈｕｓ， ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｔ５ｇ４８７９０ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ １７８ ｂｐ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＧＦＰ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｏｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ Ａｔ５ｇ４８７９０ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃａｎ ａｌｓｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器， 由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成， 其主要功能是进行光合作用， 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
植物蛋白质的亚细胞定位研究进展一、本文概述植物蛋白质在细胞中的亚细胞定位对于理解其生物功能及在植物生命活动中的作用至关重要。
近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是分子生物学、遗传学和蛋白质组学等领域的突破，植物蛋白质亚细胞定位的研究取得了显著进展。
本文旨在综述当前植物蛋白质亚细胞定位的研究现状，探讨其方法和技术，分析面临的挑战，并展望未来的发展趋势。
文章首先简要介绍了植物蛋白质亚细胞定位的基本概念和研究意义，随后综述了目前常用的定位方法和技术，包括生物信息学预测、荧光标记、免疫电镜等。
接着，文章重点分析了近年来在植物蛋白质亚细胞定位研究方面取得的重要成果，包括新发现的定位模式、定位机制以及定位与功能关系的研究等。
文章对当前研究中存在的问题和挑战进行了讨论，并提出了未来研究的方向和建议。
通过本文的综述，希望能够为植物蛋白质亚细胞定位领域的研究者提供有价值的参考和启示。
二、植物蛋白质亚细胞定位方法随着分子生物学和生物技术的快速发展，植物蛋白质的亚细胞定位研究取得了显著的进步。
亚细胞定位是理解蛋白质功能的关键环节，它有助于我们揭示蛋白质在细胞内的确切位置，从而推测其可能参与的生物过程。
目前，植物蛋白质亚细胞定位的方法主要包括生物信息学预测、荧光标记显微观察以及细胞分馏技术等。
生物信息学预测：这是一种基于计算机算法的方法，通过分析蛋白质的氨基酸序列，预测其可能的亚细胞定位。
这种方法具有快速、高效的特点，可以在蛋白质表达之前提供初步的定位信息。
目前，已有多个在线工具和数据库可供使用，如TargetP、WoLF PSORT等。
荧光标记显微观察：这种方法通过将荧光基团与特定的蛋白质标记结合，然后利用显微镜观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞位置。
常用的荧光标记技术包括绿色荧光蛋白（GFP）标记、免疫荧光标记等。
这种方法直观、准确，是目前研究蛋白质亚细胞定位的主要手段之一。
细胞分馏技术：这是一种基于生物化学原理的方法，通过利用不同细胞组分在物理和化学性质上的差异，将细胞内的各种组分进行分离和纯化，从而得到特定的亚细胞组分。
拟南芥原生质体亚细胞定位方法拟南芥（Arabidopsis thaliana）是全球植物学重要研究模式生物，其基因组已经被完整测序。
为了研究拟南芥中基因的表达和功能，确定其亚细胞定位是必不可少的一步。
一、背景知识原生质体是植物细胞中最大的细胞器，它是植物细胞内部许多生化反应的主要场所。
原生质体可分为三个部分：中央液泡、核区和质网。
中央液泡是质体中最大的结构，它包含了蛋白酶、核酸酶、糖酶和其他许多酶。
拟南芥原生质体亚细胞定位主要有细胞分选、免疫共沉淀、荧光标记和蛋白稳定同位素标记等方法。
下面将分别介绍。
1. 细胞分选细胞分选是从植物样品中分离出不同部位、不同结构的细胞器。
该方法通过等离子渗透、密度梯度离心或差速离心将细胞破碎后，对不同密度的细胞器进行分离。
细胞分选的优点是能够直接获得细胞器，不需要对蛋白进行额外操作，但是该方法需要大量植物样品，能够分离和纯化出丰富的蛋白质。
2. 免疫共沉淀免疫共沉淀是利用特异性抗体将蛋白在生理条件下结合并共沉淀的技术。
该方法主要是通过特定抗体捕获蛋白，结合到小珠树脂后，沉淀下来。
该方法的优点是可适用于体内和体外反应，适用于不同的生物体系。
不足之处是需要特异性抗体，并且不能保证蛋白完全结合在一起。
3. 荧光标记荧光标记方法是利用染色剂或荧光蛋白对靶蛋白进行标记，然后通过荧光显微镜对其进行观察。
该方法的优点是完全基于细胞和体内系统，无需操作和专门设备的需求。
不足之处是需要先知道目标蛋白的本地化位置，并且染料的选择需要针对不同的应用做优化。
4. 蛋白稳定同位素标记蛋白稳定同位素标记方法是首先以蛋白为底物，在某个部位与同位素作物标记，最终用食品相应的检测技术展现目标蛋白同位素标记。
该方法是一种直接定量分析蛋白。
足之处是可以同时研究大样本，度量范畴大，可比较分析计算机软件深层次分析讲解技术。
缺陷之处在于需要特定的设备，比如自动气相色谱和液相质谱设备，因此操作比较困难，代价也比较高昂。
第1篇实验目的：本研究旨在通过亚细胞定位技术，确定目标蛋白质在细胞内的具体分布位置，为进一步研究该蛋白质的生物学功能提供实验依据。
实验材料：1. 目标蛋白质表达质粒2. 表达载体（如pEGFP-N1）3. 农杆菌（如GV3101）4. 烟草植株5. 激光共聚焦显微镜6. 其他实验试剂和仪器实验方法：1. 构建表达载体：将目标蛋白质基因与表达载体（如pEGFP-N1）连接，构建融合表达质粒。
2. 农杆菌转化：将构建好的融合表达质粒电转化农杆菌，获得转化子。
3. 农杆菌培养：将转化子接种于YEB液体培养基中，在170rpm/min的条件下培养1小时。
4. 农杆菌悬浮：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，悬浮农杆菌。
5. 收集菌体： 4000rpm/min，离心4分钟，去除上清。
6. 重悬菌体：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.6左右。
7. 注射烟草：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
8. 培养烟草：将注射完成的烟草植株弱光培养2天。
9. 观察与拍照：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
实验结果：通过激光共聚焦显微镜观察，发现融合表达质粒中的绿色荧光蛋白（GFP）信号在烟草叶片中呈现明显的细胞内分布。
根据GFP信号的位置，可以初步判断目标蛋白质在细胞内的分布情况。
结果分析：1. 细胞核定位：若GFP信号主要分布在细胞核区域，则表明目标蛋白质定位于细胞核。
2. 细胞质定位：若GFP信号主要分布在细胞质区域，则表明目标蛋白质定位于细胞质。
3. 细胞膜定位：若GFP信号主要分布在细胞膜区域，则表明目标蛋白质定位于细胞膜。
根据实验结果，可以初步判断目标蛋白质在烟草细胞中的定位情况，为进一步研究其生物学功能提供实验依据。
讨论：1. 亚细胞定位实验是研究蛋白质生物学功能的重要手段之一。
植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254收稿日期: 2005-12-20; 接受日期: 2006-03-07基金项目: 科技部重大基础研究前期研究专项(973预研) (2003CCA01100)* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: znyang@．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊(1上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)(2中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 200032)摘要 生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。
本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。
我们克隆了该基因5'端长178 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP 。
转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP 只在叶绿体中特异表达。
实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。
本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。
关键词 融合蛋白, 亚细胞定位, 转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaPengcheng Wang 1, Chen Wang 1, Hualing Mi 2, Genyu Zhou 1, Zhongnan Yang 1*1(College of Life and Envionment Science, Shanghai Normal University , Shanghai 200234)2(Shanghai Institute Plant Physiology and Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shanghai, 200032)Abstract Bioinformatics analysis has revealed about 4 000 proteins in chloroplasts; however, only about 1 000 proteins have been validated. Thus, we established an experimental system to verify predicted chloroplast proteins. At5g48790 was predicted to be an Arabidopsis chloroplast protein.The 178 bp segment of the 5' sequence of this gene was cloned and fused with GFP to construct a binary vector pMON530-cTP-GFP for genetic transformation. On confocal laser-scanning microscopy,green fluorescent signals were localized in chloroplasts in transgenic Arabidopsis plants. The results suggest that At5g48790 encodes a chloroplast protein. This experiment can also be used to investi-gate other proteins predicted to be located in chloroplasts in Arabidopsis ．Key words fusion protein, subcellular localization, transit peptide叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器, 由叶绿体膜、类囊体和基质3部分构成, 其主要功能是进行光合作用, 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成(Motohashi et al.,2001)。
在拟南芥中, 叶绿体蛋白质绝大部分由核基因组编码在细胞质中合成, 叶绿体基因组编码87个蛋白(Abdallah et al., 2000)。
拟南芥基因组序列分析表明, 14%左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中(Abdallah et al., 2000)。
进一步的生物信息学分析表明, 拟南芥中4 255个25023(3)核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白(Friso et al., 2004), 其中25%蛋白质的功能尚不明确。
近年来, 亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力的方法。
Peltier等(2000)利用质谱和二维电泳,结合N-端Edman测序分析, 系统地分离出豌豆的61个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。
在模式植物拟南芥中, Peltier等(2002)又分离出81个内腔和类囊体周边蛋白, Kieselbach等(2000)利用蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确定了2个蛋白, Ferro等(2003)利用液相色谱技术分离出112个叶绿体膜蛋白, Schubert等(2002)则从类囊体腔中分离出36个蛋白, Friso等(2004)利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分离出154个蛋白质, Froehlich等(2003)利用改良的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白392个, Kleffmann等(2004)采用串联质谱技术(MS/MS)从拟南芥中分离出690个叶绿体蛋白。
这些实验数据的积累, 为叶绿体蛋白质的亚细胞定位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了可能, 同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提供了基础。
绝大多数叶绿体蛋白的N端具有转运肽(chloroplast transit peptide, CTP)序列特征, 通过对细胞质中合成的蛋白质前体的N端进行序列分析, 可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白质。
目前广泛应用的预测软件主要有SignalP、TargetP、LumenP、ChloroP和PSPORT等。
叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验已有报道, Mitsuda等(2001)以cDNA与sGFP构建融合蛋白用于研究AVP2基因在叶绿体中的定位, Motohashi等(2001)以APG2基因N端转运肽序列与sGFP构建融合蛋白研究其亚细胞定位。
我们利用包含转运肽的基因组DNA序列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细胞定位的实验方法, 并成功得到了未知功能蛋白AT5G48790定位在叶绿体中的信息。
１ 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col-0, 由本实验室种植(培养室条件: 22℃, 16小时光照/8小时黑暗, 光通量密度110µmol.m－2.s－1, 湿度约为30%)。
1.1.2 菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株由本实验室提供, 农杆菌ASE菌株、含GFP基因的质粒pEGFP和植物双元表达载体pMON530由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供。
1.1.3 试剂各种酶和生化试剂分别购自上海生工、大连宝生物和Sigma等公司。
1.1.4 引物合成包含基因At5g48790 N端转运肽片段的引物5'端: ATG TCA CCG TCC TTC TCC;3'端 GTC CAT GGT ATT GTT GTT ATA CCC TC (下划线表示引入NcoⅠ位点); GFP内部引物序列为5'端: GTT GAA TTA GAT GGT GAT AAT; 3'端 ATA ACC TTC GGG CAT GGC ACT C。
1.2 方法1.2.1 质粒提取、DNA片段克隆和重组质粒鉴定参照分子克隆实验指南(Sambrook and Russell, 2002)。
1.2.2 DNA片段回收采用BioDev公司回收试剂盒, 并按其说明书进行操作。
1.2.3 农杆菌介导拟南芥的转化参照浸花法(Clough and Bent, 1998)进行。
1.2.4 转基因T0代种子筛选种子用70%乙醇+0.01%Triton X-100混合液浸泡10分钟, 无菌水冲洗4次, 用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在卡那霉素抗性(50 µg.mL−1)的PNS固体培养基上, 4℃春化2天后, 在培养室中培养。
1.2.5 转基因植株的PCR检测以筛选出来的T1代植株的总DNA为模板, 采用GFP引物进行PCR扩增。
251 2006王鹏程等: 拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究1.2.6 转基因植株的激光扫描共聚焦显微镜的观察用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510 META, Zeiss)观察叶肉细胞中GFP的表达, 观察时物镜放大倍数为40倍, 激发光波长为488 nm,带通BP 505~530 nm, 长通LP 560 nm。
２ 结果2.1 叶绿体亚细胞定位双元表达载体的构建利用KpnⅠ和Eco RⅠ限制性内切酶消化质粒pEGFP, 获得包含GFP基因的750 bp片段, 将其插入到相同内切酶消化的质粒pMON530中,构建成用于叶绿体定位的双元载体pMON530-GFP(图1)。
2.2 At5g48790亚细胞定位表达载体的构建通过TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/ser-vices/TargetP)预测, 发现未知蛋白AT5G-48790N-端48aa具有转运肽结构。
以Col-0基因组DNA为模板, PCR扩增一段包含转运肽的DNA序列, 长度为178 bp, 将其命名为cTP。
cTP与pMD18-T vector 连接, 构建T-A克隆并经M13引物鉴定方向, 将正向插入克隆命名为cTP-T。
cTP-T质粒经过KpnⅠ和Eco RⅠ双酶切与用相同酶切过的载体pMON530-GFP连接构建表达载体pMON530-cTP-GFP(图2)。
2.3 转基因植株的获得将质粒pMON530-GFP与pMON530-cTP-GFP分别导入农杆菌ASE, 采用农杆菌介导法转化拟南芥。
T0代种子萌发经卡那霉素抗性筛选后, 分别得到T1代植株113棵(图3A)和42棵(图3B), 转化效率分别为0.5%和0.3%。
