细胞瞬时转染 稳定转染

瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染：外源⽚段的表达时间短暂。

这主要是因为外源导⼊的裸露的载体整合⼊基因组的⼏率⾮常低，所以以染⾊体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂⽽⼀同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。

⽽且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极⾼。

这就导致瞬时转染呈现⼀个⾼拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且⽆法在这个系统上实现可诱导表达。

稳定转染：是相对瞬时转染⽽⾔，进⼊细胞的质粒整合⼊细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。

在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。

稳定转染并不是⼀种与瞬时转染不同的⽅法，只是对瞬时转染的细胞进⾏筛选，得到稳定整合的细胞株。

稳定整合的⼏率因基因传递的⽅法⽽异，跨度可以从10-8到10-1。

因此，对于有的转染⽅法，⽐如化学试剂介导的转染，其整合⼏乎可以忽略不计。

质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递⽅法，呈现不同的靶向倾向性，所以是⼀种半随机整合。

细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。

后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。

尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。

外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。

其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。

聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。

这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。

稳定转染VS瞬时转染展开全文生物通报道：转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，是细胞和分子生物学研究的重要工具，可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。

不论是质粒、DNA还是各种RNA（mRNA、siRNA或microRNA），要将这些外源核酸转入细胞并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。

转染方法可分为物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。

上述方法都可以解决转染面临的主要挑战，即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。

物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥，使核酸插入。

而化学转染中，一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。

这些方法都可以实现转染，可谓条条大路通罗马，那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢？瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。

细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。

稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立，只不过需要一个重要的偶发过程：在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。

外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。

稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。

在建立上述稳定转染细胞系时，我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。

将这些选择性标记与基因共表达，我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞，同时剔除瞬时转染的细胞。

将外源基因与抗生素抗性基因共转染（如新霉素抗性基因neo）是一种常用方法，随后可用相应抗生素（如geneticin或G418）对转染后的细胞进行筛选。

转染转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。

比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。

如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。

生物通在前面已经为大家集中介绍了8个不同的品牌的转染试剂——不是选美，没有包医百病的万灵丹，只是希望有助于你了解每种产品的特性。

这里我们最后“唐僧”一下，转染中一些值得注意的事项。

很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA 或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。

每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。

即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。

试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。

其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。

幸好还有一些资料可寻，生物通姑且在这里抛砖引玉，罗列一些吧。

这一part很闷的。

DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。

几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。

因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。

瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。

哺乳动物细胞表达系统原理
哺乳动物细胞表达系统是一种用于生产重组蛋白和基因治疗的有效工具。

其原理主要基于哺乳动物细胞具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，使得表达的蛋白更接近天然状态。

哺乳动物细胞表达系统有两种主要方式：瞬时转染表达和稳定转染表达（稳定细胞系构建）。

瞬时转染表达是指在短时间内表达出一定量的蛋白。

外源基因不整合到宿主染色体上，随着细胞的生长不断丢失，表达小量蛋白的过程。

这种方法简捷，实验周期短。

稳定转染/稳定细胞株筛选则是指将构建好的质粒线性化，在导入到培养好
的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方法实现质粒与细胞的融合。

线性化的质粒进入到宿主细胞后，与细胞自身的基因组进行整合，同时随着细胞的生长繁殖而生长，过程中在经过一系列的筛选鉴定，排除未正确融合的重组子，或不能稳定表达下去的重组子，最终筛选出可以稳定表达的细胞株。

以上内容仅供参考，建议查阅哺乳动物细胞表达系统相关书籍获取更全面和准确的信息。

cho细胞优化蛋白表达的方式Cho细胞是一种常用的宿主细胞，被广泛应用于蛋白表达领域。

Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括以下几个方面：选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。

在Cho细胞中进行蛋白表达，需要选择适当的表达载体。

常见的表达载体包括质粒和病毒载体。

质粒载体通常用于转染Cho细胞，而病毒载体则可以通过感染Cho细胞来实现蛋白表达。

根据实验的需要，可以选择不同类型的载体，如pCDNA3.1、pLVX等。

优化启动子和信号序列也是提高蛋白表达效率的重要策略。

启动子是控制基因转录的序列，在Cho细胞中常用的启动子有CMV、EF1α等。

信号序列则是控制蛋白质转运和分泌的序列，可以选择合适的信号序列来提高蛋白表达的效率。

调节培养条件也是优化蛋白表达的重要手段之一。

Cho细胞的培养条件包括培养基的选择、培养温度、CO2浓度、培养时间等。

合理调节这些条件可以促进细胞的生长和蛋白表达。

此外，添加适当的营养物质和辅助因子，如氨基酸、维生素和抗生素等，也能提高蛋白表达的效率。

选择合适的转染方法也是Cho细胞优化蛋白表达的重要环节。

常用的转染方法包括瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染通过将表达载体导入Cho细胞，使细胞在一段时间内表达目标蛋白。

稳定转染则是将表达载体导入Cho细胞，并筛选出稳定表达目标蛋白的细胞株。

选择适当的转染方法可以提高蛋白表达的稳定性和效率。

利用辅助蛋白也是优化蛋白表达的一种策略。

辅助蛋白可以提高蛋白质的折叠和稳定性，从而增加蛋白表达的效率。

常见的辅助蛋白包括分泌辅助蛋白、折叠辅助蛋白等。

在表达目标蛋白时，可以选择适当的辅助蛋白来提高表达效果。

Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。

通过这些方式的综合应用，可以提高Cho细胞中蛋白表达的效率和稳定性，为后续的蛋白研究和应用奠定基础。

干货：细胞转染的常用方法作为一条标准的实验狗，细胞转染这条路可谓是荆棘丛生，很多实验狗们看见细胞转染率低就把细胞给扔掉了！中洪小编告诉你，千万别这样“作死”，因为实验材料也很贵的啊！！科研道路十分漫长，今天我们来看看细胞转染实验大比拼。

首先我们看看细胞转染有哪些常见方式：细胞转染途径化学介导——利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷DEAE磷酸钙法人工脂质体法物理介导——在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA 显微注射法电穿孔法基因枪法病毒介导——利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中逆转录病毒腺病毒（人脐带间充质干细胞转染图，图为本公司实验图，勿盗）小编总结了几种经典的传统方法，在此一一做一个介绍。

1磷酸钙共沉淀原理：该法可用于瞬时或稳定转染。

然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感，所得结果容易出现差异，且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性，转染效率较差。

实验步骤：将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合，同时控制好pH、温度等条件→ 室温孵育，生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀→ 将颗粒型沉淀分散到细胞中，促进DNA粘附在细胞表面→ 共沉淀通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。

2人工脂质体法原理：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。

这种方法几乎适用于所有细胞，转染效率高、重复型好，但转染时需要去除血清，转染效果随细胞类型变化大。

实验步骤：在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂→ 脂质体与核酸的磷酸骨架结合，形成复合物→ 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合→ 复合物通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

3病毒转染原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。

可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。

它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中，可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。

活性蛋白整体方案细胞转染方法比较关键词：细胞转染瞬时转染稳定转染摘要：对哺乳动物细胞转染表达蛋白来说，选择合适的转染方法和转染试剂对转染的成功率起到决定性作用。

本文主要列举了瞬时转染和稳定转染的一些方法、原理及适用性，并列举脂质体细胞转染的步骤、注意事项。

细胞转染，是指将外源基因导入细胞内的一种技术。

根据哺乳动物细胞蛋白表达流程，细胞培养完成后需进行细胞转染，根据不同的实验目的选择不同的转染方法。

目前，常用的细胞转染方法主要分为三类途径：物理介导（电穿孔法，基因枪法、显微注射法）、化学介导（脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物介导法）、生物介导（病毒介导转染、原生质体转染）。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

目前实验室常用的转染方法有脂质体转染，阳离子聚合物转染和病毒转染，不同的转染方法各有利弊，针对细胞的习性和不同的实验目的选择相对合适的转染方法。

下面列举了一些常用转染方法的原理，优缺点和适用性:细胞转染方法比较细胞转染方法细胞转染原理主要特点应用阳离子脂质体转染法带正电荷的脂质体靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物，然后通过细胞的内吞作用进入细胞a)操作简便b)适用于各种裸露的DNA和RNA片段c)适合转染各种的细胞d)对DNA浓度有一定要求e)对细胞有一定的毒性瞬时转染稳定转染所有细胞阳离子聚合物带正电的阳离子聚合物与核酸的磷酸基团形成带正电的复合物，复合物和带负电的细胞膜接触，并通过内吞作用进入细胞与脂质体转染法类似，但是具有很低的毒性，操作简单，适用性广，是新一代转染试剂瞬时转染稳定转染所有细胞磷酸钙法磷酸钙能够促进外源DNA和细胞的结合，磷酸钙-DNA复合物能够附着到细胞表面，并通过内吞作用进入细胞a)操作简单b)对DNA浓度要求高c)适用性有局限（不适用于原代细胞）瞬时转染稳定转染活性蛋白整体方案电穿孔法高脉冲的电压破坏细胞膜，在细胞膜表面形成孔道，DNA通过孔道进入细胞a)适用性广，适用于质粒和几十kb的基因组片段b)针对不同细胞要优化实验条件c)细胞致死率较高瞬时转染稳定转染所有细胞显微注射法利用显微操作系统和显微注射技术将DNA直接注入到细胞中a)整合率较高，适用于工程改造和转基因动物的建立b)操作复杂，且需要昂贵精密的设备b)外源基因的整合位点和拷贝数无法控制，会导致片段缺失、突变瞬时转染稳定转染逆转录病毒转染通过病毒的膜蛋白和细胞表面的受体相互作用而进入细胞，利用宿主细胞酶自行转录复制合成DNA，并随机整合到细胞基因组中a)转染效率高，适用于难转染细胞转染b)利用病毒介导转染，外源基因整合较稳定c)逆转录病毒只选择感染分裂细胞d)容纳外源基因长度<8kb稳定转染特定细胞转染脂质体转染步骤1）细胞培养细胞铺板，加入一定量的细胞培养液，37℃二氧化碳培养箱中培养，待细胞密度生长至80-90%时，准备转染。