pEGFP_bFGF基因转染人角膜缘干细胞的实验研究

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bFGF基因转染MSC目的基因检测

bFGF基因转染MSC目的基因检测王彦生;于宁【期刊名称】《中国继续医学教育》【年(卷),期】2015(7)18【摘要】Objective To discuss the expression of bFGF gene, after basic fibroblast growth factor (bFGF) exogenous transfection to MSC (bone marrow cells). Methods SD rats were selected. The ectomesenchymal cells were obtained from bone marrow. They were divided into control group, negative control group (transfection exogenous GFP) and experimental group (exogenous bFGF transfection on MSC), in vitro culture, bFGF gene positive expression of MSC were detected by the method of RT-PCR and ELISE in each group. Results RT-PCR showed that bFGF gene expression quantity was (0.73±0.15) in experimental group, it was significantly higher than the control group and the negative control group (P<0.05). ELISA showed that bFGF gene expression was mainly in the cytoplasm,the experimental group bFGF gene expression quantity were [supernatant (5.38±0.45)ng/L, cytoplasm (8.27±0.82)ng/L], it was significantly higher than the other two groups (P<0.05). Conclusion The application of virus mediated gene transfection to transfect exogenous bFGF to MSC can successfully achieve bFGF gene expression.%目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因外源性转染到MSC（骨髓间充质细胞）后，bFGF基因的表达情况。

人类角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞作用的实验研究

人类角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞作用的实验研究关键词：人类角膜【摘要】目的观察体外培养的人类角膜缘干细胞对同种异体外周血淋巴细胞的作用。

方法通过植片技术分离人角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。

在两种细胞单层上，观察同种异体外周血淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白Ａ（ConA）的增殖反应。

另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConＡ刺激的淋巴细胞增殖系统，以观察两种细胞释放某些因子的抑制效应。

结果单层角膜缘干细胞对ConＡ刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。

角膜缘干细胞培养上清对ConＡ刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，在72h分离上清显示有明显抑制效应。

结论角膜缘干细胞通过细胞交互作用和（或）释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。

【关键词】角膜上皮细胞;角膜缘干细胞;细胞培养Studies on the keratolimbal stem cell to the pericirculation lymphocyte activation and proliferation【Abstract】 Objective To investigate the regulation of host lymphocyte activation by the allograft of limbal stem cells.Methods Limbal stem cells and the corneal epithelial cells were cultured and isolated from human corneas by explant technique.The mediums of each cells were gathered time and were freeze at different time in -20℃after purification.Lymphocytes of the other body were cultured in mediums stimulated by Con A.Limbal stem cells or the corneal epithelial cells of the human were co-cultured with the lymphocytes from the other body��s blood.Lymphocyte proliferation assay was assessed by MTT colorimetric determination.Results Significant proliferation of the lymphocytes was shown after adding the Con A.The gathered supernatant of the 72h either from the limbal stem cells or the corneal epithelialcells was shown a potent inhibitory effect of the lymphocytes��proliferation.The monolayer domestic rabbits�� limbal stem cells，showed a significant suppressive effect on the allograft lymphocytes��proliferation after mixed lymphocyte culture for 48h，but thisphenomenon couldn��t be seen in the monolayer corneal epithelium in vitro.Conclusion The results show that there would be a lot of possible mechanisms that worked independently or worked in concert to inhibit the lymphocytes�� proliferation，but mainly by cell-cell interactionand/or some other soluble factors，and limbal stem cells would take arole on raising the eye immunity.【Key words】 corneal epithelium; limbal stem cell; cell culture在比较联合角膜缘的穿透性角膜移植与单纯大植片角膜移植的术后植片存活率的比较时发现，前者的排斥反应发生率低［1，2］，其机制尚未见研究报道，是否因为角膜缘干细胞有抑制淋巴细胞生长的功能，亦尚无此方面研究报道，我们前期的实验证实兔角膜缘干细胞可通过细胞交互作用和（或）释放某些抑制性因子抑制同种异体兔淋巴细胞的活化和增殖［3］。

bFGF促进角膜损伤修复作用及部分机制研究

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－４３３７．２０１７．０８．００１
碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）是ＦＧＦｓ超家族中重要的一员，对损伤愈合有重要调控作用¨ １］。ｂＦＧＦ是重要的促有丝分裂因子，具有很强的促细胞分裂增殖的作用，也是形态发生和分化的诱导因子。其主要的生物学作用有：促血管生长；促进刨伤愈合与组织修复；促进组织再生；参与神经再生等０］。Ａｋｉｔａ等研究发现，ｂＦＧＦ能够用于任何类型创伤的无痕治疗，愈后的伤口会呈现出更
同时伴随着相关通路的关键蛋白的磷酸化水平降低。结论：ｂＦＧＦ能够激活ＥＲＫ１／２和ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路，从而提高兔角膜基质
细胞的增殖、迁移，促进角膜损伤修复。
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；角膜基质细胞；增殖；迁移；ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ｝ｐ３８ＭＡＰＫ
在ｂＦＧＦ促进兔角膜损伤修复研究中发现，ｂＦＧＦ对兔角
膜损伤有明显的促进作用，并且能显著减少角膜瘢痕的形成］。但ｂＦＧＦ调节角膜基质层，促进兔角膜损伤修复的机制尚不清楚。在角膜损伤修复过程中，角膜基质细胞的增殖和迁移是重要的调控因素［５３。ＥＲＫ１／２信号传导通路是调控细胞增殖的重要通路［６；ｐ３８ＭＡＰＫ通路是调节细胞迁移重

人血管内皮生长因子转染人脐带源间充质干细胞的实验研究

人血管内皮生长因子转染人脐带源间充质干细胞的实验研究马跃东;杜睛精;王盼;李德华【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2011(051)012【摘要】目的研究血管内皮生长因子(VEGF)转染到人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)后VEGF表达量变化及其向神经细胞诱导能力的变化.方法用Lipofectamin法,将克隆入真核表达载体pEGFP-N3中的VEGF基因转染入hUC-MSCs,观察VEGF基因的表达对hUC-MSCs的影响.结果 VEGF基因克隆入真核表达载体,转染后经Real-time PCR和Western blot证实,在mRNA和蛋白质水平均有VEGF基因的表达,不影响hUC-MSCs的生长.结论 VEGF基因导入hUC-MSCs可以稳定表达,不影响hUC-MSC的功能.【总页数】4页(P64-66,封3)【作者】马跃东;杜睛精;王盼;李德华【作者单位】辽宁医学院,辽宁锦州121000;辽宁医学院,辽宁锦州121000;辽宁医学院,辽宁锦州121000;辽宁医学院,辽宁锦州121000【正文语种】中文【中图分类】R329;R7433【相关文献】1.构建携带 nurr1基因的慢病毒表达载体及转染人脐带间充质干细胞的实验研究[J], 胡棠生;简雯;蔡婵;涂怀军2.慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究 [J], 王力;张宁坤;徐小红;郑楠;高连如;朱智明3.神经生长因子转染的人脐带间充质干细胞促进中枢神经系统损伤修复的实验研究[J], 彭余江;李慧勇;何玺君4.人硫氧还蛋白基因重组慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究 [J], 王明辉;徐曼;张斌;陈虎5.构建携带nurr1基因的慢病毒表达载体及转染人脐带间充质干细胞的实验研究[J], 胡棠生;简雯;蔡婵;涂怀军;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人成纤维细胞细胞周期的影响

增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人成纤维细胞细胞周期的影响果磊;刘波;张恒术;任国胜【期刊名称】《激光杂志》【年(卷),期】2007(28)4【摘要】目的:观察转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因后对原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的变化,建立原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞的示踪方法。

方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,采用电转仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用荧光显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率和细胞周期的变化。

结果:增强型绿色荧光蛋白基因在转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其表达率为32.6%,细胞周期无明显的变化,且未影响成纤维细胞的贴壁过程。

结论:经pEGFP -N1质粒转染的原代培养的人癜痕疙瘩成纤维细胞仍能在体外存活,对成纤维细胞的生长没有明显的影响。

pEGFP-N1是转染原代培养的人成纤维细胞较为理想的瞬时表达载体,是研究成纤维细胞生物学行为的良好示踪剂。

【总页数】2页(P93-94)【关键词】绿色荧光蛋白;转染;人成纤维细胞;细胞周期【作者】果磊;刘波;张恒术;任国胜【作者单位】重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科【正文语种】中文【中图分类】TN248.1【相关文献】1.神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究 [J], 刘伟国;冯军峰;杨小锋;郑学胜2.增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人软骨细胞细胞周期的影响 [J], 江逊;曾耀英;何贤辉;徐丽慧;狄静芳;冯铮;肇静娴;王青;王通;史剑波3.小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究 [J], 武强;李露斯;范文辉;杨忠4.壳聚糖-负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒DNA纳米微球体外转染软骨细胞的能力及影响因素 [J], 卢华定;赵慧清;吕璐璐;王昆5.腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究[J], 鲍庆东;刘太祥;罗鑫;田祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究

bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究【摘要】目的:用Lipofectamine转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES 2 -EGFP-bFGF转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,检测转染效果及目的基因的表达情况。

材料与方法:抽取临床确诊缺血性心肌病患者髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质干细胞。

绘制生长曲线。

MTT比色法检测细胞活力。

取第二代细胞,使用Lipofectamine转染试剂,将重组真核表达质粒pIRES 2 -EGFP-bFGF转染骨髓基质干细胞,转染后4h、12h、24h、48h、72h以及传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达效率及荧光强度的变化,计算转染效率。

取各观察时间点的培养上清液,酶联免疫吸附试验检测其中bFGF的浓度。

转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色检测bFGF 的表达。

结果:缺血性心肌病患者基质干细胞在接种后24小时开始贴壁,伸展成长梭形。

MTT比色法测细胞活力达96%。

在不同时间点观测EGFP表达情况,发现在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰,72h时可见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。

ELISA 检测不同时间点转染上清液中分泌的bFGF浓度,结果在4h-48h内浓度呈渐进上升的趋势,在48h最高可达23.5ng/ml。

转染后的部分细胞形态发生变化。

转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色证实在胞浆中有bFGF颗粒着色阳性。

结论:使用Lipofectamine转染试剂可有效地转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞。

转染后的培养上清可在较长时间内检测到较高浓度的bFGF的分泌。

bFGF 基因转染可促进骨髓基质干细胞的增殖、分化。

【关键词】基质干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;缺血性心肌病;转染骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)是在骨髓中存在的一类具有多向分化潜能的细胞总称,在成体动物中仍具有在特定条件下向特定组织分化的能力。

EGF,bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响

EGF,bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响崔馨;贺翔鸽;白继【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2005(15)4【摘要】目的探讨EGF,bFGF及二者共同作用对培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响.方法用DMEM和F12(1:1)培养基,20%胎牛血清,加入不同浓度EGF,bFGF和二者的混合液,采用MTT法检测细胞的OD值.结果EGF的5～160ng/mL各浓度组增殖效应均明显大于对照组(P＜0.05),10ng/mL组明显大于其它各浓度组(P＜0.01),bFGF各浓度组从5～80 ng/mL各组均明显大于对照组(P＜0.025),20ng/mL各组明显大于与其它各组(P＜0.025);EGF与bFGF混合液各浓度组从5～80 ng/mL各组增殖效应均明显大于对照组及单独使用EGF或bFGF组(P＜0.05),EGF10 ng/mL+bFGF 20 ng/mL组促增殖效果最强(P＜0.025).结论EGF,bFGF对培养的兔角膜缘干细胞有促增殖作用,此作用均呈剂量依赖性,EGF和bFGF共同表现为明显的促增殖作用.【总页数】3页(P533-535)【作者】崔馨;贺翔鸽;白继【作者单位】重庆市第三军医大学大坪医院,野战外科研究所眼科,重庆,400042;重庆市第三军医大学大坪医院,野战外科研究所眼科,重庆,400042;重庆市第三军医大学大坪医院,野战外科研究所眼科,重庆,400042【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.LY294002联合奥曲肽对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增殖的影响 [J], 冯希敏;张凤妍2.EGF和bFGF对体外培养人视网膜色素上皮细胞增殖影响的比较 [J], 王珊珊;徐国兴3.ET-1、rhEGF、bFGF对培养的兔角膜内皮细胞的影响 [J], 胡维琨;张虹;李贵刚;王毓琴;李鹏程4.联合应用rhBMP-2与bFGF对兔骨髓基质细胞表达VEGF及其成骨潜能的影响[J], 黄涛;常祺;黄昌林;薛刚;任洪峰;赵琳;鞠晓伟5.EGF与bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞克隆形成率的影响[J], 崔馨;贺翔鸽;赵玲;宗兆文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

bFGF、EGF和NGF对人角膜内皮细胞生长调控的实验研究

bFGF、EGF和NGF对人角膜内皮细胞生长调控的实验研究邵应峰;胡诞宁;陈家祺【期刊名称】《眼科学报（英文版）》【年(卷),期】2008(024)001【摘要】目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth facfor,bFGF)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)和神经细胞生长因子(Nerve growth factor,NGF)对体外培养的人角膜内皮细胞的生长调控作用.方法:将相同数量的人角膜内皮细胞接种于96孔板.加入浓度分别为0ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/mi、100 ng/ml的EGF、bFGF和NGF进行培养.5天后MTT法用检测增殖情况.结果:在0 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml浓度下bFGF组的平均OD值分别为:0.224±0.045、0.239±0.040、0.262±0.0342、0.278±0.0319、0.281±0.0324、0.260±0.0310.EGF组的平均OD值分别为:0.228±0.0304、0.245±0.0418、0.267±0.0454、0.275±0.0347、0.271±0.0449、0.250±0.0253.NGF组的平均OD值分别为:0.216±0.0187、0.228±0.0226、0.231±0.0225、0.242±0.0279、0.245±0.0294、0.247±0.0349.结论:bFGF在30ng/ml范同内对内皮细胞生长有促进作用,并具有剂量依赖性.高于100ng/ml时促生长作用降低.EGF在10 ng/ml范围内对内皮细胞生长有促进作用.并具有剂量依赖性.高于30 ng/ml时促生长作用降低.NGF本次实验剂量范围内对角膜内皮细胞生长无明显作用.【总页数】4页(P9-12)【作者】邵应峰;胡诞宁;陈家祺【作者单位】中山大学中山眼科中心,中山大学眼科学国家重点实验室,广州510060;纽约眼耳医院组织培养研究中心,纽约医学院,纽约10003【正文语种】中文【中图分类】R77因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究作者：杨成明滕利黄谙飞来源：《中国医药导报》2013年第08期[摘要] 目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的鼠胚胎干细胞系，并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，Es细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件，为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。

方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞，对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件，定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化，观察培养后形态改变，免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。

结果转染后ES细胞稳定表达GFP，成功诱导出角膜上皮样细胞，呈典型上皮样细胞形态，免疫组化及RT-PCR检测显示，K12及CD44表达阳性，K14表达阴性。

结论转染GFP的ES细胞，在Ⅳ型胶原的诱导下，成功向角膜上皮细胞分化。

[关键词] 胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。

健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。

人的角膜自我更新由位于角膜缘外围区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。

因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。

近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。

pEGFP-bFGF重组质粒转染成骨细胞的条件优化

pEGFP-bFGF重组质粒转染成骨细胞的条件优化张丽君;丁焕文;王捷;郭勇;张宏斌;郑文岭【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2003(019)001【摘要】目的:旨在优化碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)重组质粒转染成骨细胞的条件以获得较高效率,为进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程的应用提供基础.方法:将带有EGFP的bFGF重组质粒转染成骨细胞,改变DNA、脂质体的量以及转染时间,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率.结果:在24孔培养板中,2μL脂质体介导1μg重组质粒转染10 h既可获得较满意的转染效率.结论:通过优化转染条件可提高转染效率,可为下一步基因工程细胞移植提供基础.【总页数】2页(P16-17)【作者】张丽君;丁焕文;王捷;郭勇;张宏斌;郑文岭【作者单位】510640,广州市,华南理工大学食品与生物工程学院;510010,广州军区广州总医院医学实验科;510010,广州军区广州总医院医学实验科;510640,广州市,华南理工大学食品与生物工程学院;510010,广州军区广州总医院医学实验科;510010,广州军区广州总医院医学实验科【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.两种转染试剂转染重组质粒至人肝癌细胞SMMC-7721细胞转染条件的比较 [J], 董文佩;陶珺2.重组HIF-1α真核表达质粒转染成骨细胞的条件优化 [J], 陆蕴松;刘光耀;高忠礼3.Xfect介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染Vero细胞的方法及其条件的优化 [J], 薛礼长;杨慧兰4.脂质体介导pAcGFP-bFADD重组质粒转染Hela细胞条件的优化 [J], 杨润军;李武峰;张路培;许尚忠;李俊雅;高雪;陈金宝5.重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF_(165)转染兔成骨细胞条件的优化 [J], 陈国武;孟纯阳;蒋电明;胡侦明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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第26卷　第1期2009年　2月生物医学工程学杂志Journal of Biomedical E ngineeringV ol.26　No.1Febru ary　2009pEGFP2bFGF基因转染人角膜缘干细胞的实验研究夏　凉1　赵　敏1Δ　徐　梅21(重庆医科大学附属第一医院眼科,重庆400016)2(四川省泸州医学院附属医院,泸州646000) 摘要　本研究体外培养并用抗角质蛋白K3/K12鼠单抗(A E5)鉴定人角膜缘干细胞(HL SCs),采用脂质体转染法将p EGFP2bF GF基因转染培养的HL SCs,48h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,基因转染率为20%～30%,同时制作NaO H细胞损伤模型,研究转染后的细胞对损伤的抵抗作用,转染后损伤的细胞存活状况高于未转染损伤组(P<0105),而细胞凋亡及坏死率明显低于未转染损伤组(P<0105)。

p EGFP2bF GF基因能够转染培养的HL SCs,其表达产物对碱损伤的HL SCs具有保护作用,初步探讨了基因工程联合组织工程技术治疗眼表疾病的可行性。

关键词　碱性成纤维细胞生长因子　人角膜缘干细胞　基因转染中图分类号　R3921114;R322191 文献标识码　A 文章编号　100125515(2009)0120148205Experimental Investigation of pEGFP2bFGF G ene T ransferto H uman Limbal Stem CellsXia Liang1　Zhao Min1　Xu Mei21(T he Fi rst A f f iliated Hos pit al of Chongqing Mediacal Universit y,Chongqing400016,China)2(T he Fi rst A f f iliated Hos pital of L uz hou Medical College,L uz hou646000,China) Abstract　Primary HL SCs were successfully cultured and assayed by A E5in vit ro.Constructed eukaryotic ex2 pressive vector of p EGFP2bF GF was transferred into the human limbal stem cells by the liposome2mediated tech2 nique,and48hours later,specific green fluorescence was observed by fluorescence microscope.The gene transfec2 tion efficiency was20%230%.Then the model of cells injury was created by use of NaO H.The cells were divided in2 to four groups:Normal,bF GF,NaO H and bF GF+NaO H.The cellular viability in each group was measured by M T T colorimetry,and the cellular apoptosis rate and necrosis rate were observed by laser scanning confocal micros2 copy.The cellular viability in bF GF+NaO H group was higher than that in NaO H group(P<0105),while the cellu2 lar apoptosis rate plus necrosis rate displayed significant difference between the two groups(P<0105).The p EGFP2 bb GF gene was noted to be successf ully transferred into HL SCs and the cells were found growing well.These indica2 ted that bF GF gene has a protective effect on the HL SCs injured by NaO H.We have also probed the feasibility of trying the treatment for ocular surface disease through gene engineering recombined tissue engineering.K ey w ords　bF GF Human limbal stem cells(HL SCs) Gene transfer1　引　言自20世纪70年代基因工程技术和组织工程技术结合并逐渐在眼科领域应用以来,转基因角膜缘干细胞移植在实验室研究阶段取得重大进展,采用基因转染技术获得组织工程化角膜的种子细胞是解决细胞体外培养迅速老化的一个新尝试[1]。

本实验用转基因方法,在体外研究p EGFP2bF GF基因对碱Δ通讯作者。

E2mail:minzhao2002@ 损伤的人角膜缘干细胞的保护作用。

2　材料和方法2.1　主要试剂DM EM/F12(Hyclone公司),FBS(胎牛血清, PAA公司),抗角质蛋白K3/K12鼠单抗(Mouse anti2cytokeratin3/12monoclonal antibody,A E5, Chemico n公司),异硫氰酸荧光素(Fouorescein iso2 t hiocynate,FITC,武汉博士德生物工程有限公司),脂质体转染剂(Lipofectamine2000,Invit rogen公第1期夏　凉等。

　p EGFP2bF GF基因转染人角膜缘干细胞的实验研究司),p EGFP2bF GF(上海睿星基因技术有限公司),吖啶橙(Acridine orange,AO,北方同科生物公司),溴化乙锭(Et hidium bromide,EB,北方同科生物公司)。

2.2　原代人角膜缘干细胞分离、培养及鉴定2.2.1　取材　经签定知情同意书及伦理委员会同意后,手术显微镜下无菌取死亡6h内新鲜尸眼眼球(由重庆市眼库提供),生理盐水冲洗2～3次后,放入含庆大霉素(4000U/ml)的PBS液中浸泡20 min,剖取全周浅层角膜缘组织,宽约2mm,置于无菌平皿中,移到超净工作台上,PBS液漂洗2～3次,将组织残余的庆大霉素冲洗干净后放在另一无菌平皿中。

2.2.2　细胞培养　采用组织块培养法,将上述制备好的角膜缘上皮组织置于解剖显微镜下,剪成1～2 mm2大小的组织块,上皮面朝上摆布在25ml培养瓶底,45°斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入含10% FBS的DM EM/F12培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块,置37℃、5%CO2饱和湿度恒温箱中静止培养,2h后待组织块贴壁,再追加培养基,置恒温箱中培养,隔天换液一次,在倒置显微镜下动态观察细胞形态和生长状况,当细胞融合80%以上时,即可进行传代培养。

2.2.3　细胞鉴定　分别制备原代及传代细胞爬片,用A E5及FITC对细胞进行鉴定,免疫荧光显微镜下观察结果。

2.3　人角膜缘干细胞的基因转染及观察转染前一天用0125%胰蛋白酶及0102%ED2 TA(1∶1)消化,制成细胞悬液,调整细胞浓度为2×105个/ml接种于6孔培养板(每孔115ml,孔内预置已灭菌处理的2cm×2cm盖玻片)及96孔培养板(每孔011ml)中,共4个板,置37℃、5%CO2饱和湿度恒温箱中培养过夜至70%～80%满开始转染。

按试剂盒说明采用脂质体介导法将p EGFP2 bF GF基因转染培养的细胞。

6h后更换含20% FBS的DM EM/F12培养基,转染24h后,改用常规培养基继续培养1周。

定期在荧光显微镜下观察转染结果。

2.4　细胞N aOH损伤模型制备及分组转染48h观察结果后,未转染组及转染组各取一个6孔板和96孔板,6孔板每孔加1μl NaO H (0105mol/L),96孔板每孔加15μl NaO H(0105 mol/L)。

置培养箱中培养1h。

6孔板和96孔板细胞分为未转染细胞和转染细胞,前者又分为未转染组(Normal)和未转染损伤组(NaO H),后者分为基因转染组(bF GF)和转染损伤组(bF GF+NaO H)。

每组6个样本。

2.5　检测pEGFP2bFGF基因对由N aO H损伤的人角膜缘干细胞的保护作用2.5.1　M T T检测细胞存活状况　M T T测96孔板细胞的存活状况,自动酶标仪(波长为570nm)测出每孔A值。

取每板A值均值。

2.5.2　AO/EB双染色测细胞的凋亡及坏死情况　AO/EB染色6孔板细胞后立即在激光共聚焦显微镜下观察,按镜下绿色荧光阳性细胞数/同一视野内的总细胞数比值进行荧光计数,对每一个标本随机选取4个视野,按以下公式计算细胞凋亡率及坏死率:A poptosis(%)=(V A+N V A)/Total cell count×100%N ecrosis(%)=N V N A/Tot al cell count×100%其中:VA(viable apoptotic cells)及NVA(non2via2 ble apoptotic cells)分别代表早期及晚期凋亡细胞, NVNA(non2viable nonapoptotic cells)代表坏死细胞。

2.6　统计学分析方法实验数据采用统计软件包SPSS for Windows (11.5版)进行单因素方差分析及χ2检验,组间比较采用q检验。

计量资料以 x±s表示,P<0105为差异具有统计学意义。

3　结　果3.1　细胞形态学观察HL SCs原代接种培养后24h内倒置显微镜下即可见圆形细胞生长并逐渐向组织块边缘爬行,第2d开始变形贴壁,第3～5d细胞开始呈片状生长,形态变成不规则的多边形,第7d左右细胞排列紧密成膜状,形态较规整,多为卵圆形或多边形,部分细胞膜片边缘可见基质成纤维细胞包绕生长,待细胞至少融合了80%以上时,适合传代。