微藻制备生物柴油的研究

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微藻制备生物柴油的研究
一、小球藻简介
小球藻(Chlorella)是小球藻属绿藻门,绿藻纲,绿球藻目,卵孢藻科,小球藻属,包括大约10 个种. 小球藻细胞组成中的蛋白质含量为7.3%~88%,碳水化合物为 5.7%~38%,脂类为4.5~86%。

小球藻细胞中脂类含量的增加主要是由于脂肪酸积累的结果。

在氮饥饿条件下,蛋白核小球藻在生长时可形成高达86%的脂类,而在正常的小球藻细胞中,脂类含量为25%。

在正常和氮饥饿条件下生长的小球藻在脂肪酸组成上没有明显的差异。

此外,小球藻的异养培养技术,特别是高细胞浓度培养技术的研究得到了较深入的发展,这对制备生物柴油需要高生物量的微藻来说,也是具有重要价值的。

小球藻中脂质含量的提高主要由于乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)基因在微藻细胞中的高效表达,在控制脂质积累水平方面起到了重要作用。

选择合适的分子载体,使ACC 基因在细菌、酵母和植物中充分表达,还进一步将修饰的ACC 基因引入小球藻中以获得更高效表达。

二、脂肪酶的提取、制备及油脂制备生物柴油
2.1小球藻培养
小球藻置于26℃(±1)光照培养箱通气培养, 光照强度3500lux~4500lux。

培养基成分:Glucose 10g/L,KNO32.0g/L,KH2PO41.25g/L,MgSO41.25g/L,FeSO420mg/L,初始pH8。

自养小球藻培养在标准培养基中,通过光合作用进行自养生长,从而获得绿色的自养小球藻。

通过改变标准培养基中的营养成分,即将甘氨酸成分降至0.1g/L,另加入10g/L葡萄糖,原来绿色的小球藻细胞便通过吸收葡萄糖进行异养生长,从而获得黄色的异养小球藻。

待异养藻细胞生长到对数期后期时,离心收集藻细胞。

2.2粗酶的提取和精制
用匀浆法浆细胞破碎,获得最大蛋白含量及最高总酶活的粗酶液,对细胞破碎得到的粗酶液进行硫酸铵沉淀,当硫酸铵浓度为43%时,除去杂蛋白,再将硫酸铵浓度提高到85%沉淀酶液,将沉淀溶于蒸馏水,采用透析或葡聚糖凝胶G—25脱盐。

对经硫酸铵沉淀和脱盐处理后的粗蛋白进行蛋白质含量和酶活性的测定,再将粗酶液采用强酸性阳离子交换介质进行离子交换吸附,以得到精制的脂肪酶。

2.4酶活性的测定
采用分光光度法测定脂肪酶的活性,并对反应温度,pH,底物浓度,反应时间等条件进行优化,以得出最佳反应条件。

2.5生物柴油的制备
2.1.1原料
成本过高一直是生物柴油发展的瓶颈问题,所以应该在降低原料成本上作出更大的
努力,展开以各种生物质为原料的生产途径的研究,以期最大限度降低原料成本,增加生
物柴油大规模产业化的可行性。

(1)以植物油脂为原料制取生物柴油
利用油菜籽、大豆、花生以及各种油料作物所提取的油脂为原料。

其中以油菜籽制取
的生物柴油中不饱和脂肪酸甲酯含量较多
2、微生物发酵法制取生物柴油
某些微生物如酵母、霉菌和藻类等在适合的条件下能将碳水化合物转化为油脂贮存在
体内,称为微生物油脂。

3、利用餐饮废油制取生物柴油
以植物油为原料生产生物柴油成本偏高,而将餐饮业废油脂进行回收生产生物柴油则
是一个相对较好的方案
2.2.2工艺
生物酶催化酯交换是指油脂和低碳醇在脂肪酶催化作用下进行酯交换反应,制备生物柴油。

例如:Mohamed M报道,Rhizomucor miehei、Thermo-myceslanuginosa和Pseudomonas fluorescens脂肪酶在含水量极低的正己烷、异辛烷和柴油等有机溶剂中表现出较高的催化活性。

Chen G采用来自于Rorzyae的脂肪酶来催化餐饮废油与甲醇酯交换反应,在加酶量为30wt%、醇油比4∶1、分步添加甲醇的条件下,废油可被高效转化成生物柴油。

2.3生物柴油产率的计算
将分层得到的上层粗制生物柴油先用等量的石油醚洗涤,离心12000r/min,10min,取上层有机相并用两倍体积的50℃蒸馏水洗涤,然后离心,直至完全透明。

分离出上层透明的油相,用无水硫酸钠干燥后,在旋转蒸发仪上将石油醚蒸发干净,得到澄清透明的产品生物柴油。

将产品生物柴油称重,并计算生物柴油的产率。

2.4生物柴油的分析
分析了生物柴油的密度、粘度、燃烧值、酸值、闪点,十六烷值等。

利用vario-EL元素分析仪测定生物柴油的C、H、O、N元素组成。

2.5脂肪酶的工业化生产
以上反应在大规模实际应用中存在反应体系中甲醇容易导致脂肪酶失活而失去催化能力,同时酶的价格偏高,反应时间长,反应后酶制剂不易回收等缺点,因此提高脂肪酶活性和防止酶失活是该法能否实现工业化生产的关键。

主要方法有三种:
一是探索并研制“工程小球藻”,希望能克服小球藻在基因工程改造以及进行高密度培养等技术上的困难,实现小球藻规模化养殖,降低成本,为获取油脂资源提供一条可靠的途径。

二是通过分析小球藻中脂肪酶的氨基酸序列进而得到产生这种酶的基因的序列,提取或是人工合成这个基因片段,通过基因工程手段将其整合进一种易于高密度培养的工程菌中。

三是通过吸附、交联、包埋等方法来固定化脂肪酶,固定化酶可以在反应结束后从体系中分离回收,重新催化新的反应。

三、副产物(甘油)的利用
无论采用何种方法生产,在生物柴油的生产过程中均有副产物粗甘油产生,其数量大约为生物柴油产量的10%,如何充分合理地利用这些甘油是所有生物柴油生产厂家考量最多的事。

鉴于生产条件等原因,大多数生物柴油生产厂家并没有对副产物进行深加工,多是将甘油转售到甘油精炼厂,精制为普通甘油、医药甘油等。

采用微生物发酵方法将粗甘油生成1,3-丙二醇,可以充分的综合利用粗甘油。

目前,世界上仅有美国杜邦与英国壳牌公司能够批量生产1,3-丙二醇,他们的产品一般不外卖,就算能买到,也必须承诺不得用于聚合PTT,他们基本垄断了全球1,3-丙二醇的生产、销售及下游聚合产业。

如果我国的1,3-丙二醇项目能够得以大规模连续生产,就会打破英美两国在该领域的垄断地位,填补国内空白,提高我国在高分子聚合以及纺织纤维工业的竞争力。