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核糖体展示技术
生物工程1001班 郭倩倩
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
核糖体展示技术
(Ribosome Display Technology, RDT)
是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基 础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选 的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核 糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白 的功筛选到一些 与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质， 包括抗体、 多 肽、 酶等， 是蛋白质筛选的重要工具。
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3.亲和筛选 体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反
应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定 mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实 验，也可以于4℃保存，核糖体复合物在4℃至少可以稳 定10 d，但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%-2%脱脂 奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝 素还能抑制核酸酶。
CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等 。
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产生
Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库中 筛选多肽配体。在此之前，利用前期多肽抗体 进行免疫沉淀，已经分离到了与核糖体和多肽 偶联的mRNA。Mattheakis等人首次将前人的设 想付诸实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核 糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中 ，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固 定化单抗的多肽配体。Gersuk等人利用该技术 也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外 翻译时，蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行。 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。
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原理
核糖体展示技术茎-环结 构， 将其转录成 mRNA，在无细胞翻译系统中进行翻译 ， 使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成 “mRNA-核糖体-选， 以乙二胺四乙酸（EDTA）解离结合的核糖体复合物或以 特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离mRNA。通过反转 录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测 序分析等。
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操作步骤
1.基因片段的改造 为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上
T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从 而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和 mRNA连接在一起。在对基因片段改造时,常进行多次延 伸PCR：
①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来 ②用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因和间隔子连接起来
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这些研究结果说明，如果某种蛋白质的折叠 不受核糖体蛋白通道的影响，那么与核糖体的解 离就不是该蛋白获得天然构像的必要条件。1997 年，Plückthun实验室在以上研究成果的基础上 ，对Mattheakis的多聚核糖体展示技术进行了改 进，建立了体外筛选完整功能蛋白(如抗体）的 新技术：核糖体展示技术。
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（2）若分别进行,则需要控制RNase的影响。VRC—过渡态类似物— 作为RNase抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率 。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低 RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免
核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响。
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启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转 录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就 像“开关”，决定基因的活动。启动子也应由DNA组成。 启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因 子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。质粒设计时都 需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子 可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括
②mRNA的分离
筛选完后，加入含20 mmol/L EDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。 洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR( 反转录PCR）反应重新引入T7启动子和SD序列等核糖体展示必需元 件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效率。将 最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以 得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型) 表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。
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①亲和筛选
分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等 认为,ELISA方法中，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水 作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体 分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签， 如生物素，然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素 捕获该标签,进行亲和筛选。
，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端茎环结构序列。 ③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子序列和5′端茎环
结构序列,下游产物同前。最后得到的PCR产物,5′端接上T7启 动子和茎环结构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有3′ 端的茎环结构。
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2.体外转录和翻译
体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系 统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统 ,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶 联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译 系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。 （1）对于含二硫桥的ScFv抗体(单链抗体）和其它蛋白质,转录和翻 译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确 折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其 稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/ 翻译偶联体系效果可能更好.。
