小鼠淋巴细胞的分离培养

兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学是兽医学专业中的一门重要课程，它研究动物身体对病原微生物的免疫应答和免疫调节机制。

免疫学实验教学是培养学生免疫学实践能力的重要环节，通过实验教学，学生能够更好地理解和掌握免疫学的理论知识，并培养其实验操作技能。

实验一：抗原与抗体的相互作用在这个实验中，学生将学习抗原与抗体的相互作用原理。

首先，学生将收集不同种类的抗原，如细菌、病毒等，并制备相应的抗体。

然后，学生将进行免疫沉淀实验，通过观察抗原与抗体的反应，来判断抗体的特异性和亲和力。

实验二：淋巴细胞的分离与培养淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞类型，它们在免疫应答中起着关键作用。

在这个实验中，学生将学习淋巴细胞的分离与培养技术。

首先，学生将从小鼠或大鼠的淋巴组织中分离出淋巴细胞。

然后，学生将对淋巴细胞进行培养，并观察其生长和增殖情况。

实验三：细胞毒性试验细胞毒性试验是评价细胞免疫功能的重要方法之一。

在这个实验中，学生将学习细胞毒性试验的原理和操作技巧。

首先，学生将从小鼠或大鼠中分离出淋巴细胞，并与靶细胞进行共培养。

然后，学生将通过测定靶细胞的存活率来评估淋巴细胞的细胞毒性能力。

实验四：酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。

在这个实验中，学生将学习ELISA的原理和操作方法。

首先，学生将制备ELISA板，并将抗原或抗体固定在板上。

然后，学生将加入特异性的抗体或抗原标记物，并通过酶的反应来检测目标物质的存在和浓度。

实验五：免疫组化染色免疫组化染色是一种常用的免疫学实验技术，用于检测组织中特定抗原的分布和表达情况。

在这个实验中，学生将学习免疫组化染色的原理和操作方法。

首先，学生将制备组织切片，并进行抗原的抗体染色。

然后，学生将观察组织切片中抗原的分布和表达情况。

通过以上实验，学生将能够全面了解免疫学的基本原理和实验技术，并培养其实验操作技能和科学研究能力。

小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。

以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。

2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。

常用的方法包括机械破碎和离心分离。

3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。

4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。

5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。

一般培养24-72小时。

6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。

7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。

8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。

9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。

10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。

这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。

淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。

二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。

2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。

3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。

三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。

3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。

4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。

5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。

四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。

2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。

3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。

4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。

nkt细胞培养步骤nkt细胞（Natural Killer T cell）是一类具有免疫调节和杀伤活性的淋巴细胞，其在免疫系统中发挥着重要的作用。

nkt细胞的培养是研究nkt细胞生物学功能以及开发相关治疗的重要手段之一。

下面将介绍nkt细胞培养的基本步骤。

1. 细胞来源选择nkt细胞可从小鼠或人体中分离获得。

一般来说，从小鼠脾脏或淋巴结中分离的nkt细胞含量较高，易于培养；而从人体中分离的nkt细胞数量较少，需要经过多次刺激才能扩增。

因此，选择合适的细胞来源对于nkt细胞的培养至关重要。

2. 细胞分离和纯化从小鼠脾脏或淋巴结中分离的细胞通常含有一定比例的nkt细胞，但需要进行纯化以提高纯度。

常用的纯化方法包括磁珠分离、流式细胞术等。

从人体中分离的nkt细胞则需要经过多次刺激，如使用CD1d分子结合的α-半乳糖苷类似物来激活。

3. 细胞培养基选择nkt细胞的培养基选择要根据实验需要和细胞来源的不同进行调整。

一般来说，RPMI 1640培养基是最常用的培养基之一，其中添加10-20%的胎牛血清或小牛血清可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。

4. 细胞培养条件nkt细胞的培养条件需要注意温度、湿度和二氧化碳浓度的控制。

一般来说，37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的条件下培养效果较好。

此外，还需要定期更换培养基，以保持细胞的健康生长。

5. 细胞激活和扩增nkt细胞的激活和扩增是培养过程中的关键步骤。

对于小鼠来源的nkt细胞，可以使用α-半乳糖苷类似物（如α-GalCer）来激活细胞，并添加适量的白细胞介素-2（IL-2）来促进细胞扩增。

对于人体来源的nkt细胞，可以使用CD1d分子结合的α-半乳糖苷类似物来激活，并添加IL-2和IL-15等细胞因子来促进细胞扩增。

6. 细胞检测和鉴定在nkt细胞培养的过程中，需要定期检测细胞的纯度和活性。

常用的检测方法包括流式细胞术、酶联免疫吸附试验等。

此外，还可以使用特定的细胞标记物来鉴定nkt细胞的表型和功能。

“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。

1/ 1。

药物对动物体内淋巴细胞增殖影响实验具体步骤及实验方法1. TIL的分离及培养（1）取荷瘤小鼠20只，处死后无菌条件下切除皮下瘤块，置于RPMI 1640培养液中，剔除坏死的肿瘤组织及表面结缔组织，剪碎过细胞筛收集单细胞悬液。

（2）将等体积的比重1.088及1.075淋巴细胞分离液及细胞悬液先后分别置于离心管中进行不连续密度梯度离心，经1800 r/min 离心20 min 后，1.075界面上为富含肿瘤细胞悬液，1.088与1.075之间界面为富含TIL悬液。

（3）收集TIL，用含10%小牛血清，IL-2100 u/ml RPMI1640培养液稀释调整细胞浓度成5×105/ml进行培养，分两组。

（4）一组每5天加入冷冻瘤苗，浓度为效应细胞/肿瘤细胞（E/T）=50/1，另一组不加冷冻瘤苗进行常规培养。

（5）培养条件为37℃，5%CO2，每5天计数1次，维持细胞浓度5×105/ml。

2. 冷冻瘤苗的制备（1）取肿瘤细胞悬液，用RPMI 1640培养液稀释成1×105/ml 装于冻存管中（2）用液氮速冻慢融3个冻融周期，置于-20℃冰箱中贮存，备用。

3. 荷瘤小鼠模型的制备（1）抽取腹水型Hepa种鼠腹水，用生理盐水稀释至肿瘤细胞1×106/ml，于小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 ml。

（2）1周后肿瘤长至直径约0.5 cm 左右即制成小鼠荷瘤模型供检测TIL抗肿瘤作用。

（3）待肿瘤生长至直径1~2 cm 时供分离TIL使用。

4. 培养后TIL的抗肿瘤作用分3组，每组20只小鼠。

对照组瘤体内注射生理盐水0.2 ml；实验1组，瘤体内注射常规培养TIL1×106个；实验2组，瘤体内注射加入冷冻瘤苗培养TIL1×106个。

隔3天注射1次，共6次。

5. 病理检查处死小鼠，测量肿瘤大小，结果用垂直方向直径平均值表示。

肿瘤组织送病理检查，常规HE染色。

淋巴细胞浸润程度根据Anneroth等的标准分为4级。

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。

2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。

3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。

二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。

在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。

本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。

四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。

- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。

- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。

- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。

- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。

2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。

- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

- 每2天更换一次培养基。

3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。

4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。

- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。

- 加入抗体，37℃孵育30分钟。

- 加入底物，观察颜色变化。

- 记录抗体生成细胞活性。

五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。

2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。

六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。

2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。

小鼠淋巴细胞分离液说明书Cat#:DKW33-R0100本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。

主要成份为Iodixanol ，分子量为1550。

它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。

EZ-Sep™Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。

本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。

产品信息：商品名：EZ-Sep™Mouse 1×（英文）易得小鼠淋巴细胞分离液（中文）规格：100mL/瓶密度：1.0810±0.0005g/mL (20ºC)渗透压：280±15mOsm主要成份：Iodixanol ，化学惰性，无生物毒性内毒素：≤0.5EU/mL适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞分离大鼠/兔子血液中的PBMC保存方法：4ºC 避光保存，保持无菌保质期：12个月使用方法：自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁成90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等实验步骤：1.断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。

2.在超净台中取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3.在35mm 培养皿中放入4-5mL EZ-Sep™Mouse 1×淋巴细胞分离液（取用前摇匀）。

研磨（研磨操作请参考图二）。

4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL 离心管中，覆盖200-500uL 的1640培养基（保持液面分界明显）。

5.室温，800g 离心30min 。

淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。

通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。

淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。

淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。

其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。

取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。

脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。

首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。

第二步，制备单细胞悬浮液。

将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。

随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。

第三步，加入淋巴细胞分离液。

将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。

淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。

第四步，离心分离。

将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。

离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。

离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。

第五步，收集淋巴细胞。

将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。

用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。

重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。

通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。

这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。

淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。