基因工程1

第四章酶

同尾酶：有一类限制性内切核酸酶，他们来源各异，识别的靶序列也不同，但切割后能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。

同裂酶：是一类来源于不同的微生物，能识别相同的靶序列的限制性内切核酸酶。首次发现的酶叫原型酶，而后发现的与原型酶识别序列相同的酶叫做原型酶的同裂酶。其中，识别序列相同、而切割位点与原型酶不同的酶叫做新裂酶。

Klenow酶：枯草杆菌蛋白酶可以将DNA聚合酶Ⅰ水解为N端的小片段和C端的大片段。其中的大片段被称为Klenow片段。它保留了DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。Klenow酶的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性。

反转录酶：即依赖于RNA的DNA聚合酶，具有5′→3′DNA合成活性和很强的RNAaseH活性，但是无3′→5′外切活性。反转录酶能以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）。

限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。

DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3‘-OH末端与5’-P末端之间通过生成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶

黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，他们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。

平末端：平末端指DNA分子两条链在限制性内切酶作用下断裂的位置是处在一个对称结构的中心，形成的一种平齐的末端结构类型。

星号活性(staractivity):也称星活性，同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，最值这种现象称为星号活性。

限制与修饰现象：限制作用：即在一种宿主细胞生长良好的入噬菌体，但在另一种宿主细胞中生长很差。

修饰作用:第二个寄主菌株赋予1噬菌体非遗传的变化，使之再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。限制作用和修饰作用都是由寄主控制，统称为寄主控制的限制与修饰现象。

限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基化酶的甲基化作用。

当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA,使之打上标记，避免自身的DNA被限制性内切酶分解;限制酶降解外来的DNA，自身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统。

R-MSystem限制与修饰系统:限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断，细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

回文序列：回文结构是指在DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基序列正读和反读都相同的双螺旋结构。

碱性磷酸酶：用于脱去DNA(RNA)5'末端的磷酸基团，使5'-P成为5'-OH。该过程称为核酸的脱磷酸作用，可以防止载体的自连接，提高载体与DNA片段的重组效率。此酶可以来自大肠杆菌或小牛肠，后者更为常用。

DNA聚合酶Ⅰ：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的一些核苷酸上切割DNA分子双链，但它的切割核苷酸序列是随机的，无专一性。

切口平移：DNA聚合酶I在体外从DNA分子切口处开始复制，即利用双链DNA分子单链上磷酸二酯键断裂产生的3-OH作为引物开始合成;新合成的DNA片段将取代原有的同源链，这条同源链会被DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性降解，使新链合成过程中切口的位置沿着DNA双链移动。这一过程称为切口平移，常用于标记DNA片段。

Taq酶：是一类具有良好聚合活性和热稳定性的DNA聚合酶，常用于PCR,该酶具有5’→3'聚合酶活性及5'→3'外切酶活性，但没有3→5'外切酶活性，故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能。另外，TaqDNA聚合酶还具有末端转移酶作用，可用于T-A克隆。

T-A克隆：TaqDNA聚合酶具有末端转移酶作用,能在所合成DNA链的3末端加上一个单独的腺苷酸残基(A)。这样的PCR产物可直接与带有3-T的线性化载体（T载体）连接。这一方法被称为T-A克隆。

第三章载体

质粒：是存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主复制共价闭合环状的DNA分子。

选择标记基因：选择基因（又称选择标记基因），主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因，这种基因在执行其选择功能时，通常存在检测慢（蛋白酶作用需要时间）、依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）等缺陷。 穿梭质粒：人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记而可在两种不同的寄主中存活和复制的质粒载体。

接合型质粒：部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛、合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞中。分子比较大，拷贝数比较少，并且宿主广，比较不安全。

非接合型质粒:不含tra基因的质粒则不具备转移性，他们的分子量小，拷贝数多，不会自动转移，比较安全。

质粒的不亲和性:也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。相反则称为相容性。

复制子:是指从一个DNA复制起始点开始的一段DNA复制区域。它是一个独立的复制单位，包括复制起始点和终点。

T载体:聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。

载体:能携带外源基因(或DNA片段)进入细胞复制、整合或表达的工具称为载体。

pYAC:酵母人工染色体质粒载体，YAC载体是以质粒pBR322为基础,由人工装配而成,具有染料体的关键部分中心粒、端粒和复制中心,克隆位点和筛选标记。

烈性噬菌体:指凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体.烈性噬菌体进入菌体后就改变宿主的性质,使之成为制造噬菌体的工厂大量产生新的噬菌体,最后导致菌体烈解死亡。

温和噬菌体:是指凡吸附并侵入细胞后,噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上,并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制,因而在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体。

ori:是指DNA复制所必需的、可以控制其合成的一段特殊DNA序列。原核生物只有一个复制起始点;真核生物则有多个。不同生物的复制起始点序列不尽相同，但均含有短的重复序列，可被相关蛋白识别和结合。

多克隆位点（MCS）：multiplecloningsites:DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

Cos位点：线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5',单链突出序列，即粘性末端。注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5'—P和3'—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。

松弛型质粒：其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。

严谨型质粒：同宿主细胞的复制是偶联的，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒，分子量较大；拷贝数较少。

λ置换型载体：可被外源DNA置换的入噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体，即载体具有一个限制性内切酶的两个切点，两点间为非必需基因区，可以相应除去一部分，并被外源DNA取代。

λ插入型载体：一般只含有一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，其DNA已经失去了非必需区，仅保留了ECORI的单一切点，而且这个切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选。

λgt11:载体大小为43700bp，插入了乳糖操纵子的启动子及lacZα，可提供对重组子的蓝白斑筛选。

柯斯质粒：又称“粘端质粒”。一种人工构建的质粒载体。含有λ噬菌体的ＣＯＳ位点及一个或多个选择性标记。兼有细菌质粒和λ噬菌体的优点，能容纳比自身ＤＮＡ大得多的外源ＤＮＡ，进入寄主细胞后能象质粒一样进行复制。

粘粒克隆载体：包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载40Kb左右的外源DNA片段。由于黏粒载体带有噬菌体的包装序列，可以用包装蛋白包装，不带外源DNA片段的载体因为包装下限而不能被包装，具有很强选择性。包装产物通过感染宿主菌高效地将重组DNA导入宿主细胞。黏粒载体被用于构建基因组文库。

BAC载体：细菌人工染色体是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。该质粒主要包括oriS，repE(控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。以BAC为基础克隆的载体成嵌合体的频率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。 报告基因：是一种表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

第二章

电泳：指的是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。

电泳技术：在电场力的作用下，利用待分离样品中各种分子带点性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

转染：以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。

转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。

转化：指以质粒为载体，将外源DNA导入处于感受态的大肠杆菌等原核宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。

DNA变性：是指双链DNA在变性因素（如过酸、过碱、加热）的影响下，由于碱基之间的氢键断裂而解链成单链的过程。变性后其理化性质和生物学活性均有所改变;但一级结构未变，故在一定条件下仍可复性。

DNA复性：在适宜的条件下，将变性条件缓慢出去，互补的DNA单链又重新缔合成双链的过程。最常见的复性即退火。

EtBr(溴化乙锭、EB)：溴化乙锭是一种有机化合物，是一种核酸染料，能掺入到双链DNA中，在紫外光激发下发出橙红色荧光，可用于对DNA的染色观察，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色。

分子量marker:DNAMarker是分子生物学核酸技术的必备试剂之一,其作用是DNA样品在进行琼脂糖凝胶电泳时作为DNA的标准参照物,以便于直观判断样品DNA大小.

磷酸二酯法：

磷酸三酯法：用于核酸化学合成的一种方案,是将活化的核苷3′-磷酸单体与另一个核苷酸的5′-OH基连接,形成磷酸三酯。

电激转化:是利用瞬时、高强度的电场作用，对生物膜形成可逆的通透性，细胞膜在电脉冲作用时形成微孔，同时摄取外源DNA分子，从而获得遗传转化。

Southern印迹杂交:是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量.